人参皂苷Rb1减轻阿霉素诱导心肌细胞自噬的保护作用お

[摘要] 该研究以H9c2细胞为研究对象，采用阿霉素诱导心肌细胞自噬活化，探讨人参皂苷Rb1对阿霉素诱导心肌细胞自噬的作用。应用CCK8法、透射电镜观察、荧光染色观察、Western blot等方法分别检测药物作用后H9c2细胞的增殖以及自噬变化。结果显示，阿霉素引起H9c2细胞活力下降，导致H9c2细胞的自噬相关结构增加、自噬标志性蛋白LC3由LC3I 转变为LC3Ⅱ增加及p62蛋白表达降低；人参皂苷Rb1可以减弱阿霉素引起的心肌细胞活力下降并抑制阿霉素诱导的自噬相关结构增加、LC3I 转变为LC3Ⅱ的增加以及p62蛋白表达的降低。以上结果提示，阿霉素可引起H9c2细胞死亡并诱导细胞自噬的活化，而人参皂苷Rb1对阿霉素诱导心肌细胞死亡具有保护作用，这种作用可能是通过调节自噬a生的。

[关键词] 人参皂苷Rb1； 阿霉素； 自噬； H9c2细胞

Protective effect of ginsenoside Rb1 on doxorubicin

induced myocardial autophagy

LI Longfei， MA Zengchun*， WANG Yuguang， TANG Xianglin， TAN Hongling， XIAO Chengrong， GAO Yue*

（Institute of Radiation Medicine Science， Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100850， China）

[Abstract] Ginsenoside Rb1（Rb1）， which is one of the main ingredients derived from Panax ginseng， has been found to have extensive pharmacological activities including antioxidant， antiinflammatory， anticancer properties. In this study， the effect of Rb1 on doxorubicininduced myocardial autophagy was studied with H9c2 as the study object. CCK8 method， transmission electron microscope observation， fluorescence staining observation and Western blot were used to detect changes in H9c2 cell proliferation and autophagy after treatment. According to the results， doxorubicin could cause cell viability decrease， significant increase in the LC3Ⅱ/LC3I ratio and downregulation of the expression of p62. Pretreatment with ginsenoside Rb1 inhibited cell viability decrease and increase in doxorubicininduced autophagic structure and LC3Ⅱ/LC3I ratio， and downregulation of the expression of p62. In conclusion， doxorubicin could induce H9c2 cell death and induce autophagy， and ginsenoside Rb1 showed a protective effect on DOXinduced cardiotoxicity， which may be correlated with suppression of DOXinduced autophagy.

[Key words] ginsenoside Rb1； doxorubicin； autophagy； H9c2 cell

自噬是细胞受到刺激后产生双层膜囊泡包裹胞内物质运送到溶酶体降解的过程，是真核生物所特有的进化保守过程，其主要功能是清除和降解细胞内受损的细胞结构和衰老的细胞器以及外来物，保持细胞稳态[1]。近年研究发现，自噬不但参与心血管系统稳态的调控，而且在心肌肥大、心肌纤维化、心肌缺血再灌注损伤、心力衰竭等多种病理过程中发挥重要作用[25]。人参为五加科植物人参Panax ginseng C. A. Mey.的干燥根和根茎，是我国传统名贵中药材，在我国药用历史悠久，对多种疾病具有防治效果。人参皂苷Rb1是人参的主要有效成分之一[6]。现代药理研究证明，人参皂苷Rb1可明显改善缺血性心脏病、各型心律失常、急性或慢性心力衰竭等心脏疾病[7]。阿霉素属于周期非特异性抗肿瘤药。文献报道，其具有心脏毒性并且会导致心肌细胞自噬性死亡[810]。因此，本研究拟用阿霉素建立心肌细胞自噬损伤模型，探讨人参皂苷Rb1对阿霉素诱导心肌自噬的影响。

1 材料

1.1 药品与试剂 人参皂苷Rb1购于上海一飞生物科技有限公司（批号E049517，纯度98%）；阿霉素（doxorubicine，DOX）、3MA购自美国Selleck Chemicals公司；DMEM高糖培养基、青霉素链霉素双抗溶液购于GE医疗公司；胎牛血清（FBS）购自天津康源生物技术有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS）、PremoTM Autophagy Tandem Sensor RFPGFPLC3B Kit购于美国赛默飞世尔科技公司；CCK8试剂盒购于日本同仁化学研究所；AntiSQSTM1/p62抗体购自英国Abcam公司；LC3B抗体购自美国CST公司；实验用水为超纯水；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器 VICTOR X型多标记酶标仪（美国Perkin Elmer公司）；SM 510 META激光扫描共聚焦显微镜（德国Zeiss公司）；日立透射扫描电子显微镜H7650（日本日立集团）；Microfuge 22R型离心机（美国Beckman公司）；CO2培养箱（美国Thermo公司）；Millipore SimplicityTM185超纯水机（德国Merck集团）；VIBS223S电子天平（德国Sartorious公司）。

1.3 细胞系 本研究采用大鼠胚胎心肌细胞系H9c2（21）作为实验对象，此细胞系购自北京协和细胞资源中心（Cell Resource Center，IBMS，CAMS/PUMC）。

2 方法

2.1 细胞培养 H9c2细胞培养于含10%FBS的DMEM高糖培养液中（含青霉素钠100 units・mL-1，链霉素100 mg・L-1），放入37 ℃，5%CO2培养箱中培养。2 d更换1次培养液，待细胞生长至约80%时用0.25%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期细胞进行实验。

2.2 细胞活力检测 取对数生长期细胞接种于96孔板中，每孔1×104个细胞，置于培养箱中培养。实验设置调零孔（只加培养基不加细胞）、细胞对照孔和实验孔，每组设置3个复孔。待细胞培养24 h后弃去上清培养液，加入用含2%FBS的DMEM培养基配成的各浓度受试药物，在培养箱中培养适当时间后，每孔加入CCK8试剂10 μL，培养箱内孵育约1～2 h，使用酶标仪在450 nm处测定吸光度。细胞存活率=（A给药组CA调零孔）/（A对照组CA调零孔）×100%。

2.3 电镜观察自噬体 细胞给药处理后采用刮刀法收集细胞，经过前固定、漂洗、后固定、漂洗、脱水、浸透、包埋、切片等步骤制成超薄切片进行透射电镜观察。

2.4 RFPGFPLC3B融合蛋白示踪自噬形成 按照PremoTM Autophagy Tandem Sensor RFPGFPLC3B Kit说明书，每1万细胞中加入2 μL转染试剂，孵育16 h，将RFPGFPLC3B融合蛋白转染至H9c2细胞。转染成功后进行给药处理，采用激光共聚焦显微镜进行观察。

2.5 Western blot 法检测自噬相关蛋白 取对数生长期细胞接种于25 cm2细胞培养瓶中，每瓶约5×104个细胞。进行给药处理后，收集各培养瓶细胞，离心，PBS漂洗，加入细胞裂解液，提取细胞总蛋白。经BCA法测定蛋白浓度及变性后，进行SDSPAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉或BSA封闭，分别加入LC3B，p62和GAPDH抗体，4 ℃孵育过夜。次日，TBST洗膜3次，加入HRP标记的二抗室温孵育90 min，TBST洗膜3次后用化学发光法显影，采用Image J软件进行条带分析。

2.6 稻莘治 数据用±s表示，计量资料组间比较采用单因素方差分析；统计分析软件使用GraphPad Prism 5.0，以P

3 结果

3.1 人参皂苷Rb1减轻阿霉素引起的细胞损伤 阿霉素0，0.5，1，2.5，5，10，20 μmol・L-1处理24 h后，采用CCK8法检测H9c2细胞活力的变化。结果显示，阿霉素在1～20 μmol・L-1对H9c2细胞活力具有显著的抑制作用，且呈明显的量效关系（图1）。不同浓度的人参皂苷Rb1预处理6 h后加入5 μmol・L-1DOX共孵育24 h，采用CCK8法检测细胞活力。结果显示，人参皂苷Rb1可以逆转阿霉素导致的H9c2细胞活力下降，表明人参皂苷Rb1可以抑制阿霉素诱导的H9c2细胞死亡（图2）。

3.2 阿霉素诱导H9c2细胞自噬活化模型的建立 为了选择合适的浓度以及时间进行阿霉素自噬模型的建立，分别采用0，0.5，1，2.5，5，10，20 μmol・L-1 DOX处理细胞12 h和1 μmol・L-1DOX处理细胞0，3，6，12，24，48 h后提取细胞蛋白，采用Western blot法检测自噬相关蛋白的变化。结果显示，阿霉素可剂量依赖性（0～10 μmol・L-1）以及时间依赖性（0～48 h）地导致LC3BⅡ/ LC3BⅠ升高并使p62蛋白含量降低，表明阿霉素可导致H9c2细胞自噬活化。根据数据分析结果，选择1 μmol・L-1DOX处理细胞12 h进行造模（图3）。

3.3 人参皂苷Rb1抑制阿霉素诱导的H9c2自噬活化 50 μmol・L-1人参皂苷Rb1预处理6 h加入1 μmol・L-1DOX共孵育12 h后，收集细胞，制备超薄切片，采用透射电镜观察自噬体。与对照组相比，DOX组可以明显观察到自噬结构，人参皂苷Rb1预处理组自噬结构则不明显（图4）。

将RFPGFPLC3B融合蛋白转染至H9c2细胞后，50 μmol・L-1人参皂苷Rb1和5 mmol・L-13MA分别预处理6 h加入1 μmol・L-1DOX共孵育12 h后，进行荧光观察。与对照组相比，DOX组merge后红色荧光明显增强，提示RFPGFPLC3B融合蛋白多定位于溶酶体或自噬溶酶体内，即自噬流活化（图5）。人参皂苷Rb1预处理与自噬抑制剂3MA预处理组merge后红色荧光减弱，提示其抑制DOX诱导的自噬活化（图5）。

50 μmol・L-1人参皂苷Rb1和5 mmol・L-13MA分别预处理6 h加入1 μmol・L-1DOX共孵育12 h后，采用Western blot法检测自噬相关蛋白的变化。结果显示，人参皂苷Rb1预处理与自噬抑制剂3MA预处理组LC3BⅡ/LC3BⅠ明显低于DOX组，同时p62蛋白表达亦有部分升高，但无统计学差异。提示人参皂苷Rb1可以抑制DOX诱导的自噬活化（图6）。

4 讨论

[16] Orogo A M， Gustafsson B. Therapeutic targeting of autophagy： potential and concerns in treating cardiovascular disease[J]. Circ Res， 2015， 116（3）： 489.

[17] Klionsky D J， Abdelmohsen K， Abe A， et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy （3rd edition）[J]. Autophagy， 2016， 12（1）： 1.

[18] Wang R X， He R L， Jiao H X， et al. Ginsenoside Rb1 attenuates agonistinduced contractile response via inhibition of storeoperated calcium entry in pulmonary arteries of normal and pulmonary hypertensive rats[J]. Cell Physiol Biochem， 2015， 35（4）： 1467.

[19] Wang X F， Liu X J， Zhou Q M， et al. Ginsenoside Rb1 reduces isoproterenolinduced cardiomyocytes apoptosis in vitro and in vivo[J]. Evid Based Complement Alternat Med， 2013， 2013： 454389.

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[21] Yan X， Tian J， Wu H， et al. Ginsenoside Rb1 protects neonatal rat cardiomyocytes from hypoxia/ischemia induced apoptosis and inhibits activation of the mitochondrial apoptotic pathway[J]. Evid Based Complement Alternat Med， 2014， 2014： 149195.