ELISA法检测血清中HBsAg的结果不确定度分析

目前ELISA法在临床检验中已被广泛应用,具有一定的代表性,而有关ELISA法检测结果的不确定度评定的应用报道很少。本文根据JJF1059―1999《测量不确定度评定与表示》[1],通过对典型例子不确定度的分析和量化,建立了ELISA法检测HBsAg结果不确定度的评定程序,通过对检测结果不确定度的评估,对检测结果进行完整地表达,避免或降低了出现假阴性结果的风险。

1 材料与方法

1.1 材料

试剂为乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法),上海科华生物技术有限公司产品。设备为Thermo MK3型酶标读数仪。依据GB15990―1995《乙型病毒性肝炎的诊断标准及处理原则》[2]进行检测。

1.2 方法

在板架上放好酶标板条,每孔加入50 μL待测血清或阴、阳性对照,设阴、阳性对照各2孔。每孔加入酶结合物50 μL,置37℃孵育30 min。洗板5次后,每孔加显色剂A液、B液各50μL,置37℃孵育15 min。每孔加入终止液50 μL后,用酶标仪读数,取主波长450 nm,参考波长630 nm读取各孔OD值。

2 结果

2.1 被测物数学模型

公式:ΔA=S-CO

式中:ΔA―结论判定;S―待测血清吸光度值(OD值);CO―临界值(cut-off)=NCx×2.1。NC―阴性对照OD值;NCx―阴性对照平均OD值;2.1为修正系数。

2.2 结果判定

当阴性对照OD均值0.05时以实际OD值计算。ΔA≥0者为HBsAg阳性,ΔA

2.3 不确定度的来源

待测样品(S)的OD值和临界值(CO)是不确定度的主要来源。

2.4 两种情况不确定度分量的量值及其相对贡献

设NC1=0.008、0.006,同板中任意一个样品吸光度S=0.042时,当阴性对照OD值

设NC2=0.059、0.061,同板中任意一个样品吸光度S=0.042时,当阴性对照OD值>0.05时以实际OD值计算,见表2。

3 讨论

3.1 分析和量化不确定度分量

3.1.1 临界值 CO的不确定度就是阴性对照平均值(NCx)的不确定度,NCx的不确定度主要由2个分量组成,即:由系统效应引起的阴性对照OD值NC的不确定度和由重复性试验(只有当阴性对照OD值NC大于0.05时)中随机效应rep引起的不确定度。阴性对照NC代表的是阴性对照在某特定波长下的吸光度值,根据朗伯一比耳定律,吸光度值与吸光系数(a或ε)、液层厚度(b)和阴性样液浓度(C0)成正比,对于某一特定的显色反应来说,吸光系数是个常数。因此吸光度值的不确定度主要与液层厚度和阴性对照样液浓度有关。

3.1.1.1 液层厚度b 影响液层厚度的主要因素就是溶液的最终体积,即:显色液物A(V2 )、B(V3)各50μL(V2、V3)+50μL终止液(V4)。由于3次取用溶液使用的是同一规格的移液器,所以由此产生的不确定度也是相同的。而影响移液器的体积不确定度的主要因素是移液器的校准(C)和温度效应(T)。① 移液器的校准(C)产生的不确定度u(C):根据JJG646―2006《移液器检定规程》[3]的要求,使用的50μL移液器其准确度为±3% ,按矩形分布处理,校准引入的标准不确定度为:

u(C)=50×3%/3=0.87(μL)

② 温度效应(T)产生的不确定度u(T):容量器皿的校准在20℃下进行,假设实验室的温度在(20±4)℃之间波动,水的膨胀系数为2.1×10-4 /℃[4],按矩形分布50μL的移液器由温度效应引入的标准不确定度为:

u(T)=50×4×2.1×10-4 =0.04(μL)

由于校准和温度效应是相互独立的两个分量,因此,显色液A 50μL(V2)的标准合成不确定度u(V2)为[1]:

u(V2)=∑Ni=1u2i(y)=u2(C)+u2(T)=0.87(μL)

同理,显色液B 50μL(V3)的标准合成不确定度u(V3)为:u(V3)=0.87(μL)。

同理,终止液50μL(V4)的标准合成不确定度u(V4)为:u(V4)=0.87(μL)。

因为u(V2)、u(V3)和u(V4)为相互独立的3个分量,由此,液层厚度b的标准合成不确定度u(b)为:

u(b)=u2(V2)+u2(V3)+u2(V4)=1.51(μL)

3.1.1.2 阴性对照样液浓度C0 阴性对照样液浓度取决于阴性对照样液量(V1)的大小,因此取决于移液器的准确度。同样影响移液器的体积不确定度的主要因素是移液器的校准(C)和温度效应(T)。

u(V1)=u(V2)=0.87(μL)

因为影响阴性对照样液浓度的仅有阴性对照样液体积一个分量,所以阴性对照样液浓度C0的标准不确定度为:

u(C0)=u(V1)=0.87(μL)

3.1.1.3 合成阴性对照NC的不确定度 液层厚度b和阴性样液浓度C0是相互独立的两个分量,又是相乘的关系,有[1] 2=∑Ni=12

,则NC的合成标准不确定度u(NC)为:当阴性对照NC1=0.008、0.006时(小于0.05时以0.05计算)的合成标准不确定度u(NC1)=0.05×u2(b)/502+u2(c0)/502=0.0017;当阴性对照NC2=0.059、0.061时(大于0.05时以实际OD值计算)的合成标准不确定度u(NC2)=0.06×u2(b)/502+u2(c0)/502=0.0021。

3.1.1.4 重复性rep 按照说明书要求,一次检测需做二个阴性对照试验。平均值标准不确定度为u

(x-)=u(xi)/n(n为重复次数)[1],则2次重复检测平均值NCx的合成标准不确定度u(NCx)为:

①当NC1=0.008、0.006时,阴性对照OD值小于0.05时以0.05计算,NCx1=0.05,u(NC1)= 0.0017,重复性影响可忽略。所以u(CO1)=u(NCx1)= u(NC1)=0.0017。

②当NC2=0.059、0.061时,阴性对照OD值大于0.05时以实际OD值计算,NCx2=0.06,u(NC2)=0.0021。根据JJF1059-1999,采取极差法近似评定单次测量结果的实验标准差为:0.002/1.13=0.0018,则u(rep)=0.0018/=0.0013。将阴性对照OD值NC的不确定度和重复性rep的不确定度进行合成,同样因为NCx与rep是相互独立的两个分量,所以u(CO2) =u(NCx2)=u2(NC2)+u2(rep)=0.0025。

3.1.2 待测样品S 待测样品吸光度值S的不确定度主要由样品的液层厚度u(b)、样液浓度u(c1)、重复性u(rep) 3个不确定度分量组成。待测样品S不确定度分量u(c1)和u(b)分别与阴性质控对照NC的不确定度分量u(c0)和u(b)的意义相同,数值相等,即:

u(c1)=u(c0)=0.87(μL)

u(b)=1.51(μL)

两者合成标准不确定度为:0.042u2(b)/502+u2(c1)/502=0.0015

3.1.3 样品重复性rep 对一未知样品作10次重复测定,测定结果见表3。

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3.1.4 样品S合成不确定度 u(S)=0.00122+0.00152=0.0019

3.2 检测结果合成标准不确定度uc(ΔA)的计算

由于临界值CO的不确定度和待测样品S的不确定度是相互独立的分量,因此uc(ΔA)=

u2(CO)+u2(S)。

3.2.1 当NC1=0.006,0.008,S=0.042时,NC1小于0.05以0.05计算。NCx1=0.05,Cut-off= NCx×2.1=0.105,u(CO1)=0.0017,u(S)=0.0019。

uc(ΔA1)=u2(CO)+u2(S)=0.0025

3.2.2 当NC2=0.059,0.061,S=0.042时,NC2大于0.05以实际OD值计算。NCx2=0.06,Cut-off= NCx×2.1=0.126,u(CO2)=0.0025,u(S)=0.0019。

uc(ΔA2)=u2(CO)+u2(S)=0.0031

3.3 各分量的相对贡献

用每个分量的标准不确定度除以检测结果的标准不确定度,得到每个分量不确定度的相对贡献[4]。由此可知,CO(NCx×2.1)与S的吸光度值的不确定度对检测结果不确定度的贡献都是不可忽视的。

3.4 HBsAg检测结果的报告

当NC1=0.006、0.008时,阴性对照OD值小于0.05时以0.05计算,NCx1=0.05, 重复性可忽略, Cut-off=NCx1×2.1=0.105,S=0.0042。取k=2,则U=2uc(ΔA1)=2×0.0025=0.005。如下报告本例HBsAg检测结果:由于本例方法属单边检测,所以ΔA1=(S+U)-CO1=0.042+0.005-0.105,k=2。若ΔA≥0判定为阳性反应;若ΔA

当NC2=0.059、0.061时,阴性对照OD值大于0.05时以实际OD值计算,NCx2=0.06,Cut-off=

NCx2×2.1=0.126,S=0.0042。取k=2,则U=2uc(ΔA2)=2×0.0031=0.006。如下报告本例HBsAg检测结果:由于本例方法属单边检测,所以ΔA2=(S+U)-CO2=0.042+0.006-0.126,k=2。若ΔA≥0判定为阳性反应;若ΔA

考虑到测量不确定度对检测结果的影响,本例报告的结果与通常方法判定的结果之间相差一个数值U(0.005/0.006),它意味着在ΔA+U(0.005/0.006)区间内包含了检测结果可能值的较大部分。因此,可以避免承担更大风险的可能性。

4 参考文献

[1]测量不确定度评定与表示. JJF1059―1999.

[2]乙型病毒性肝炎的诊断标准及处理原则. GB15990―1995.

[3]移液器检定规程. JJG646―2006.

[4]曹志军,卢利军,高岚.测试实验室中测量不确定度评定.长春:吉林科学技术出版社,2003:141.

(收稿日期:2009-04-07)

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