8羟基脱氧鸟苷在2型糖尿病大鼠肾脏的表达及瑞舒伐他汀钙的影响

【摘要】 目的 观察8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)在2型糖尿病模型大鼠肾脏的表达及瑞舒伐他汀钙(Rosuvastatin)对它的影响。方法 将大鼠分为正常对照组(C)、糖尿病组(D)、瑞舒伐他汀钙治疗组(N)，比较各组大鼠肾组织中丙二醛(MDA)含量、超氧化物岐化酶(SOD)活性，和8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量，同时观察血糖、血胰岛素、肾功能和肾脏形态变化。结果 与正常组比较，糖尿病组血液中MDA含量明显上升(P

【关键词】

8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)；瑞舒伐他汀钙；糖尿病肾病；氧化应激

The effects of rosuvastatin on 8-hydroxyguanine expressing in the kidney of type 2 diabetic rats

XU Xin,ZHAO Kai.

Department of Endocrinology,The First People’s Hospital of Shangqiu city,Shangqiu 476100,China

【Abstract】 Objective

To evaluate the expression of 8-hydroxyguanine(8-OHdG) in type 2 diabetic rats and the effect of Rosuvastatin on it.Methods 25 rats were divided into 3 groups of normal rats(C)，diabetic rats(D),and diabetic rats treated with Rosuvastatin (N).Content of malonaldehyde(MDA) and activity of antioxidant enzymes including superoxid edismutase(SOD) and 8-OHdG in the renal tissue were compared among the groups.In addition，blood glucose，serum creatinine(Cr) and blood ureanitrogen(BUN)were mesured；the renal tissue were observed by light micros copy and electron microscopy.Results Compared with normal group，the level of BUN，Cr， MDA and 8-OHdG in Rosuvastatin untreated group were significantly increased，but the activity of SOD were decreased notably.In addition，the renal pathologic changes in Rosuvastatin untreated group was also decreased,but improved in the treared group obviously.Conclusion Oxidative stress takes key point in the development of diabetic nephropathy.The expression of 8-OHdG in type 2 diabetic rats are increased. Andantioxidation may be the possible mechanism of the nephroprotective action of Rosuvastatin.

【Key words】

8-hydroxyguanine(8-OHdG); Rosuvastatin; Diabetic nephropathy; Oxidarive stress

越来越多的实验表明，糖尿病的并发症是糖尿病致死致残的主要原因，但其机制尚不清楚，糖尿病时糖代谢紊乱介导的氧自由基生成可能参与了糖尿病慢性并发症的发生。肾组织中的氧化／还原平衡状态的破坏，造成的肾脏氧化应激反应，可能参与了糖尿病肾病的发生[3]。而8-OHdG是DNA氧化损伤的产物，故它可以作为反映DNA氧化损伤的生物指标，从而反映糖尿病的发生发展。瑞舒伐他汀钙上市以来，主要作为降胆固醇及抗动脉粥样硬化药。近年来，大量资料及体内外试验表明，其也有很强的抗氧化作用。因此，本实验以2型糖尿病(diabetes mellitus,DM)模型大鼠为研究对象，观察瑞舒伐他汀钙对该模型大鼠肾脏8-OHdG的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 25只清洁级Wistar大鼠，雄性，购自河南大学动物中心，体重100~150 g。

1.1.2 试药 链尿佐菌素(STZ，德国MERCK公司，以0.1 mol／L、PH为4.2的枸橼酸缓冲液溶解，临用前配制)；瑞舒伐他汀钙(商品名可定，阿斯利康制药有限公司)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、8-OHdG检测试剂盒(日本Japanese aged control institute)。

1.1.3 仪器 紫外分光光度计 (上海分析仪器厂)；自动生化分析仪 (美国Technicon公司)；磁酶联免疫测定仪(北京倍爱康生物技术有限责任公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与处理 大鼠适应性饲养1周后，按体重随机分为正常对照组 (C组，7只)和实验组(B组，18只)。C组给予普通食料，B组给予高糖、高脂饮食 (由常规饲料加15％蔗糖、5％猪油、0.5％胆固醇配制而成)。4周后B组腹腔注射STZ(注射量为35 mg／kg)，72 h后经尾静脉采血测空腹血糖(FBG)。以禁食后血糖水平≥7.8为标准，判定2型糖尿病大鼠模型是否建立成功，成功者(共 14只)。再随机分为糖尿病组 (D组，7只)和糖尿病可定治疗组(N组，7只)，N组以可定500 mg／(kg/d)灌胃，C组、D组则给予相同剂量的蒸馏水各组大鼠均单笼饲养，自由进食、饮水。给药8周后代谢笼收集24 h尿液，低温离心后测尿微量白蛋白。后麻醉大鼠，自下腔静脉取血，摘取双侧肾脏，称重，取部分皮质以4％的多糖甲醛固定，部分以3.7％的戊二醛液固定。

1.2.2 检测项目与方法

1.2.2.1 生化指标的检测 血糖水平用葡萄糖氧化酶法检测，血胰岛素水平采用磁酶联免疫吸附法检测，血尿素氮 (BUN)、血肌酐(Cr)由自动生化分析仪检测，24 h尿微量白蛋白采用放射免疫法测定。

1.2.2.2 肾组织中MDA含量、SOD活性的测定 取0.5 ml组织匀浆，低温离心，取上清液，采用化学比色法测定光吸收度，计算MDA、SOD含量。

1.2.2.3 肾组织免疫学检查 常规脱蜡，封闭，一抗37℃孵育2 h，4℃冰箱过夜，标记二抗，作免疫染色，应用高清晰度彩色免疫图像分析系统(IPP55.0)分析，测定肾小球(平均光密度)直径。

1.2.2.4 肾脏组织电镜观察 肾组织固定，脱水，包埋，切片，染色，在Hitachi-7500透射电镜下观察。

1.3 统计学方法

实验数据以x±s表示，应用SPSS 13统计软件进行处理，两组间数据采用ANOVA检验，若方差不齐，采用非参数统计检验，P

2 结果

2.1 各组大鼠血糖、肾功能及病理形态的变化

与C组相比，D组大鼠经高糖、高脂饮食喂养4周后，经腹腔注射STZ后，血糖明显升高，达到糖尿病模型标准, 造模8周后，D组尿ALB,BUN、Cr值，肾重／体重与C组比较明显升高；经可定治疗后，N组体重有明显增长，肾脏重量虽无明显变化(P>0.05)，但其肾重及肾重／体重均明显低于D组(P

2.2 正常对照组、糖尿病组、糖尿病可定治疗组病理改变

镜下观察发现，D组大鼠GBM明显增厚，系膜区增宽，部分肾小球出现硬化，经可定治疗后，上述病理改变得到改善。

2.3 正常对照组、糖尿病组、糖尿病可定治疗组超微结构改变

电镜下观察可见，C组肾小球基底膜结构清晰完整，血管内皮细胞足细胞未见异常。D组基底膜不均匀增厚，内皮细胞排列紊乱，脱落，完整性破坏，足突增粗融合。肾小管上皮肿胀。部分溶酶体内可见空泡变性，线粒体肿胀。N组亦可见上述变性，但程度较D组减轻。

2.4 各组大鼠肾组织中MDA含量、SOD活性及8-羟基脱氧尿苷(8-OHdG)的变化

3 讨论

氧化应激是指机体内高活性分子如活性氧类自由基(reactive oxygen species,ROS)和活性氮类自由基(reactive nitrogen species,RNS)产生过多或消除减少，过多的自由基直接引起生物膜脂质过氧化，细胞内蛋白质及酶变性，DNA损伤，从而导致细胞死亡或凋亡，组织受损。

本研究发现，12周后，糖尿病大鼠各种氧化应激指标包括MDA和8-OHdG都明显增高，而抗氧化指标SOD则明显低于正常对照，说明2型糖尿病大鼠的抗氧化能力明显下降，氧自由基生成增多，促进了糖尿病的发生，这与近年的其他研究一致[1,2]。

本研究还表明糖尿病的氧化应激与糖尿病肾病的发生存在密切关系，2型糖尿病大鼠成模12周后，BUN，Cr和ALB升高，DBM增厚，系膜区明显增宽，部分肾小球出现硬化，足突成阶段性融合，说明高糖状态下肾脏功能和形态均受到损伤。相关分析表明糖尿病大鼠尿白蛋白排量与8-OHdG和 MDA呈正相关，与SOD呈负相关, 说明氧化应激参与了糖尿病肾病的发生发展[3]。Chang JM等[4]发现局部氧自由基水平与肾小球硬化和系膜增生相关，在糖尿病发展中起重要作用。因此，抗氧化治疗可减轻DM引起的肾脏损伤。

8-OHdG被认为是DNA氧化应激损伤的重要标志物[5,6]。当机体修复机制正常时，这种DNA氧化损伤产物被机体的特异性DNA修复酶hOGG1等从DNA链上切除并重新渗入正常的鸟嘌呤碱基而经肾脏随尿排泄，因而其含量可以反映机体的DNA氧化损伤程度，是目前国际上公认的一种新型的评价机体的DNA氧化损伤和机体氧化应激状态的敏感指标和生物标志物。近年研究发现糖尿病肾病时8-OHdG表达明显增高[7]，是肾小球细胞蛋白质氧化应激的指标。本研究发现成模后的2型糖尿病大鼠肾脏的8-OHdG表达明显高于正常组(P

本研究通过瑞舒伐他汀钙干预2型糖尿病大鼠模型。造模12周后，发现瑞舒伐他汀钙治疗组氧化指标MDA的水平明显减少,SOD的含量增加，同时使尿白蛋白水平下降，肾脏病理和超微结构都有明显的好转，表明其改善了氧化应激状态，缓解了肾损伤，保护了肾脏功能。瑞舒伐他汀钙自上市以来，主要作为降胆固醇及抗动脉硬化药。近年来，大量资料表明，瑞舒伐他汀钙的强抗氧化作用较其降脂作用更强。Yoshida M等均发现瑞舒伐他汀钙对体内脂质有较强的抗氧化作用[8,9]，Umeji K等[10]在一些干预动脉硬化的实验中发现可定能够减少8-OHdG的含量，其机制为通过减少NADPH的氧化反映来减少ROS的含量。但有关瑞舒伐他汀钙干预肾脏8-OHdG表达国内外未见类似报道。本实验就对此问题进行了研究，实验发现瑞舒伐他汀钙治疗组肾脏8-OhdG的表达较糖尿病组明显下降(P

总之，通过此次实验证实，评估糖尿病的氧化应激水平对预测和预防其并发症是很重要的。瑞舒伐他汀钙作为一种抗氧化剂不仅可以抑制脂质过氧化物的生成亦可以抑制DNA的氧化损伤，其临床前景值得进一步探讨研究。

参 考 文 献

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