黑豆红色素对亚硝酸盐体外清除作用的研究

摘 要：该文以黑豆红色素为试验材料，采用分光光度法研究了不同的pH值、反应温度、反应时间、黑豆红色素浓度等条件对亚硝酸盐体外清除作用的影响，确定黑豆红色素体外清除亚硝酸盐的最佳条件。结果表明，黑豆红色素对亚硝酸盐具有较强的体外清除作用，在黑豆红色素浓度为5.5mg/mL、pH为2.6、反应温度为37℃、反应时间为4h时清除率最大，达到了99.50%，高于对照Vc。

关键词：黑豆红色素；亚硝酸盐；清除率

中图分类号 TS264.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）19-0039-03

Abstract：Making Black beans red pigment as material， the influence of different pH， reaction temperature， reaction time， black beans red pigment concentration conditions on the nitrite scavenging effect in vitro by spectrophotometric method are studied， to ascertain the best condition of black beans red pigment removal of nitrite in vitro. Research shows that black beans red pigment of nitrite has strong influence on vitro， while the black beans red pigment concentration is 5.5 mg/mL， pH is 2.6， the reaction temperature is 37 ℃，and reaction time is 4 h， clearance reaches the largest to 99.50%， higher than controls Vc.

Key words：Black beans red pigment；Nitrite；Clearance

亚硝酸盐是一种普遍存在于人们生产和生活中的物质。在食品中，亚硝酸盐可以作为肉制品的护色剂和增色剂，还可增加肉的风味，同时可以作为防腐剂使用，防止及阻止肉毒梭菌的生长和增长肉制品的货架期。但由于亚硝酸盐是强氧化剂，其大量进人体后会引起高铁血红蛋白症，使血液中低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，失去运氧的功能，致使组织缺氧，出现青紫而中毒，还可使血管扩张、血压降低。另外，亚硝酸盐被人体食入之后，会在人体内形成亚硝胺，而亚硝胺是一种强烈的致癌作物质，引起食道、胃、肝和大肠等部位的癌症。目前，国内外一些学者从植物中提取出天然活性成分对亚硝酸盐进行了清除作用的研究[1-9]。黑豆红色素就是一种天然的、无毒无害的常用食品添加剂[10]，具有延缓衰老、保肝护肝、抗菌、抗肥胖等作用[11-14]。本文通过研究黑豆红色素对亚硝酸盐体外清除的作用，研究各种反应条件对亚硝酸盐体外清除率的影响，确定黑豆红色素体外清除亚硝酸盐的最佳条件，旨在为开发天然植物源的亚硝酸盐体外清除剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器 黑豆红色素，课题组自制[15]；无水乙醇、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠、柠檬酸、磷酸氢二钠、Vc等均为国产分析纯。UV―1601紫外可见分光光度计：北京瑞利分析仪器有限公司；RE―52旋转蒸发仪：郑上海亚荣生化仪器厂；DHG-9145A电热鼓风干燥箱：上海凯朗仪器设备厂；HH―6数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；Neofμge 13R台式高速冷冻离心机：上海力申科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 亚硝酸钠标准曲线的绘制 参照GB 5009.33-2010食品安全国家标准《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的分光光度法，亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺法测定。分别吸取0（零管）、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5mL亚硝酸钠标准使用液（5.0μg/mL），分别置于25mL带塞比色管中。分别往比色管中添加1mL对氨基苯磺酸溶液（4g/L），摇晃混合均匀，静止放置3～5min后在依次分别加入0.5mL盐酸萘乙二胺溶液（2g/L）。加水至比色管上刻度线，摇晃混合均匀，静止放置15min，用零管调节零点，于波长538nm处测吸光度值。每组试验样品做三次平行试验，以亚硝酸钠浓度（μg/mL）为横坐标、吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程：y=0.0256x+0.0046，相关系数R2=0.997。

1.2.2 不同条件下黑豆红色素对亚硝酸盐体外清除作用的影响

1.2.2.1 pH值 在6支25mL比色管中分别加入2.0mg/mL的黑豆红色素溶液1mL，然后各加入1mL亚硝酸钠标准溶液（200μg/mL），加入pH分别为2.6、3.0、3.4、3.8、4.2、4.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液8mL，混匀后于37℃下反应1h。吸取1mL上述反应液于比色管中，按照1.2.1的方法测定538nm处的吸光度值，并计算其亚硝酸盐含量，然后按下式计算黑豆红色素对亚硝酸盐的体外清除率：

清除率（%）=[（A+C-B）/A]×100

式中：A为空白实验反应液的亚硝酸盐含量，B为加入黑豆红色素反应液的亚硝酸盐含量，C为用蒸馏水代替亚硝酸钠标准溶液反应的反应液的亚硝酸盐含量。

1.2.2.2 反应温度 在10支25mL比色管中分别加入2.0mg/mL的黑豆红色素溶液1mL，然后各加入1mL亚硝酸钠标准溶液（200μg/mL），加入上一步试验得出的最适pH的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液8mL，混匀后于20、30、37、40、50、60、70、75、77、80℃下反应1h。吸取1mL上述反应液，按照1.2.1的方法测定538nm处的吸光度值，并计算其亚硝酸盐含量，然后按1.2.2.1中公式计算黑豆红色素对亚硝酸盐的体外清除率。

1.2.2.3 反应时间 在14支25mL比色管中分别加入2.0mg/mL的黑豆红色素溶液1mL，然后各加入1mL亚硝酸钠标准溶液（200μg/mL），加入上一步试验得出的最适pH的醋酸缓冲溶液8mL，混匀后在上一步试验得出的最适反应温度下反应0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0h。吸取1mL上述反应液，按照1.2.1的方法测定538nm处的吸光度值，并计算其亚硝酸盐含量，然后按1.2.2.1中公式计算出黑豆红色素对亚硝酸盐的体外清除率。

1.2.2.4 黑豆红色素浓度 在12支25mL比色管中分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5mg/mL的黑豆红色素溶液1mL，然后各加入1mL亚硝酸钠标准溶液（200μg/mL），加入上一步试验得出的最适pH的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液8mL，混匀后于上一步试验得出的最适反应温度下反应最适的时间。吸取1mL上述反应液，按照1.2.1的方法测定538nm处的吸光度值，并计算其亚硝酸盐含量，然后按1.2.2.1中公式计算出黑豆红色素对亚硝酸盐的体外清除率。

1.2.3 黑豆红色素与Vc对体外清除亚硝酸盐作用的比较 取5支25mL比色管中分别加入0、4.0、4.5、5.0、 5.5mg/mL的黑豆红色素和Vc溶液1mL，然后各加入1mL亚硝酸钠标准溶液（200μg/mL），加入pH2.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液8mL，混匀后于37℃下反应4h。吸取1mL上述反应液，按照1.2.1的方法测定538nm处的吸光度值，并计算其亚硝酸盐含量，然后按1.2.2.1中公式计算出对亚硝酸盐的体外清除率。

1.2.4 数据处理与分析 每组试验重复三次，所有数据在WPS表格中进行统计分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 不同pH值下黑豆红色素对亚硝酸盐体外清除作用的影响 由图1得出，在研究的pH值范围（2.6～4.6）内，黑豆红色素对亚硝酸盐的体外清除作用随pH值的升高而减小，在pH2.6时，体外清除率最高，达到59.44%。这表明在环境条件为酸性，接近人体胃液的条件下，黑豆红色素对亚硝酸盐具有较高的体外清除作用。

2.2 不同反应温度下黑豆红色素对亚硝酸盐体外清除作用的影响 由图2得出，黑豆红色素对亚硝酸盐体外清除率随反应温度升高清除率逐渐升高，说明温度对黑豆红色素清除亚硝酸盐有很大的影响。如果以人体内部为前提，尽量将温度定在接近人体的温度。由图2可以看出，反应温度在30～40℃，黑豆红色素对亚硝酸盐体外清除率基本变化不大，即可以参照人体的温度，选取37℃进行后续的实验。

2.3 不同反应时间下黑豆红色素对亚硝酸盐体外清除作用的影响 由图3得出，黑豆红色素对亚硝酸盐的清除率随着时间的延长而升高，反应时间从0.5～3.0h呈现一个明显的增长趋势，而后又稍微下降之后又再升高。当反应时间达到4h之后，清除率基本不再增长，维持在80%以下，说明最佳的反应时间为4h。

2.4 不同黑豆红色素浓度对亚硝酸盐体外清除作用的影响 由图4得出，在不同的黑豆红色素浓度下，黑豆红色素浓度与对亚硝酸盐的体外清除率呈正相关关系，清除率随黑豆红色素浓度增大而增大。黑豆红色素浓度在0.5～2.5mg/mL增长明显，在2.5～5.5mg/mL增长相对缓慢，在5.5mg/mL黑豆红色素对亚硝酸盐的体外清除率达到最高，清除率可达99.50%。

2.5 黑豆红色素与Vc对亚硝酸盐体外清除作用的比较结果 由图5可以看出，随着Vc的浓度的升高，其对亚硝酸盐的清除率而增大，但在同样条件下，黑豆红色素有明显的优越性。黑豆红色素浓度为4.0mg/mL时，清除率达到94.24%，而Vc仅为59.48%；黑豆红色素在最适浓度5.5mg/mL时对亚硝酸盐的体外清除率达99.50%，Vc为80.14%。由图5可以看出，浓度在4.5～5.5mg/mL，Vc的清除作用虽然明显增强，但远远不及黑豆红色素的清除效果。

3 结论

亚硝酸盐经常被用于某些食品中以增强其商品性，但存在一定的食品安全风险。本研究通过对黑豆红色素体外清除亚硝酸盐的条件，如pH值、反应温度、反应时间、黑豆红色素浓度等进行优化，明确了不同条件对黑豆红色素体外清除亚硝酸盐的影响作用，并得到了最佳的清除条件，即：当黑豆红色素浓度为5.5mg/mL时，在pH2.6下，反应温度为37℃下反应4h，黑豆红色素对亚硝酸盐体外清除率达到99.50%。在同等条件下与Vc进行对照比较之后，发现黑豆红色素有比Vc更好的体外清除效果。黑豆红色素不仅可以作为食品添加剂用于食品着色，也可作为亚硝酸盐体外清除剂使用。

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（责编：张宏民）