长松萝中酚类化学成分研究

[摘要]采用硅胶、Sephadex LH20和半制备HPLC等色谱方法，从长松萝乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位中分离得到16个化合物，经MS，NMR等波谱技术鉴定为2， 6， 2′三羟基4甲基二苯甲烷（1），lecanorin（2），3hydroxy5methylphenyl 2hydroxy4methoxy6methylbenzoate（3），lecanorin E（4），3′methylevernic acid（5），evernic acid（6），坝巴酸（7），3，7dihydroxy1，9dimethyldibenzofuran（8），苔黑酚（9），苔黑素单甲醚（10），methyl orsellinate（11），methyl everninate（12），2， 5二甲基间苯二酚（13），2羟基4甲氧基3， 6二甲基苯甲酸（14），扁枝衣酸乙酯（15），苔黑酚羧酸乙酯（16）。化合物1为首次以天然产物形式获得，定名为长松萝酚。化合物3，4，8，10，12和13为首次从松萝科植物中分离得到。除2，5，10外的其他化合物经体外抗炎活性筛选，结果显示1，8，13对RAW2647细胞中NO生成有显著的抑制活性。

[关键词]长松萝；长松萝酚；酚酸；化学成分；抗炎活性

[Abstract]Sixteen compounds were isolated from lichen Usnea longissima using of various chromatographic techniques including silica gel， Sephadex LH20， ODS， and semipreparative HPLC By spectroscopic data analyses， their structures were identified by as useanol（1）， lecanorin（2）， 3hydroxy5methylphenyl 2hydroxy4methoxy6methylbenzoate（3）， lecanorin E（4）， 3′methylevernic acid（5）， evernic acid（6）， barbatinic acid（7）， 3，7dihydroxy1，9dimethyldibenzofuran（8）， orcinol（9）， Omethylorcinol（10）， methyl orsellinate（11）， methyl everninate（12）， 2，5dimethyl1，3benzenediol（13）， 2hydroxy4methoxy3，6dimethyl benzoic acid（14）， ethyl everninate（15）， and ethyl 2，4dihydroxy6methylbenzoate（16） Compound 1 was obtained as a natural product for the first time， and 3，4， 8，10，12， and 13 were isolated from Usneaceae family for the first time Compound 1， 8， and 13 showed significant antiinflammatory activity against NO production in RAW 2674 cells with IC50values of 68， 39 and 48 μmol・L-1， respectively， compared with the positive controls curcumin（IC50153 μmol・L-1） and indomethacin（IC50429 μmol・L-1）

[Key words]Usnea longissimia； useanol； phenolic； chemical constituents； antiinflammatory activity

doi：10.4268/cjcmm20161017

松萝科Usneaceae松萝属Usnea地衣全世界约600余种，广泛分布在北半球、欧洲、北美洲。我国约有10种，各地均有分布，多生长在阴湿的林中，附生于针状树上[1]。本属多种植物入药用，如松萝具有清热解毒、止血、止咳化痰、清肝功效，多用于治疗头痛、目赤、外伤出血、毒蛇咬伤等症[23]。

长松萝U. longissimia为多年生枝状地衣，由真菌和藻类共生而成。主要分布于、四川、云南、甘肃、陕西、黑龙江、吉林、湖北、安徽、浙江等地[4]。是中医、蒙医和藏医等民族常用药材。藏药名为“塞尔固”，具有清热解毒功能。藏医代表性著作《四部医典》记载其主治肺热、肝热、脉热，毒热[4]；蒙药称“斯日古德”，即“阿拉坦乌塔斯乌布斯”，《中国医学百科全书・蒙医学》、《蒙药志》等均列为正品，主治毒症、肠刺痛、腹鸣，泄泻，肠热，筋腱疼痛，肺脓疡等[3]。研究表明长松萝主要含酚酸类成分，如多取代单苯[58]、缩酚[6]、蒽醌[9]、二苯并呋喃[5，910]等，具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗氧化等药理及生物活性[11]。为了寻找活性酚酸类成分，本课题组对长松萝进行了化学成分研究。本文主要报道从长松萝乙醇提取物的乙酸乙酯部位分离得到的16个非松萝酸类成分，包括6个缩酚类（2～7），8个多取代单苯类（9～16）等。其中1为首次以天然产物形式获得，化合物3，4，8，10，12和13为首次从松萝科植物中分离得到。

1材料

Varian 500 MHz核磁共振仪（Varian，美国）；LCMSITTOF系统（Shimadzu，日本）；制备型高效液相色谱仪（Waters）；半制备色谱柱ReprosilPur Basic C18（10 mm×250 mm，5 μm）；Sephadex LH20填料（Pharmacia）；旋转蒸发仪（Buchi）；柱色谱用RpC18（40～63 μm，Merck）；色谱硅胶（200～300目）及薄层色谱用GF254硅胶预制板均为青岛海洋化工厂产品；所用的提取分离溶剂均为分析纯，为北京化工厂产品。SANYO MCO18AIC细胞培养箱；瑞士TECAN M1000型多功能酶标仪；Motic AE2000倒置荧光显微镜；胎牛血清（Gibco）；DMEM培养基（Hyclone）；NO试剂盒（南京建成生物公司）；阳性对照为姜黄素和吲哚美辛（Sigma）。

长松萝U longissimia干燥地上部分于2013年7月采于四川省甘孜州甘孜县，经本文作者屠鹏飞教授鉴定，凭证标本（No UL201307）存放于北京中医药大学中药现代研究中心。

2提取与分离

干燥的长松萝地上部分（30 kg）以90%和70%乙醇各提取1次，合并提取液并减压回收，得乙醇提取物（约25 kg）。以水分散后依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，得到萃取部分。乙酸乙酯部位（10 kg）经硅胶柱色谱（200～300目）分离，二氯甲烷甲醇（30∶1～0∶1）洗脱得到9个流分（Frs A～I）。Fr A经硅胶柱色谱分离，石油醚乙酸乙酯（6∶1～0∶1）洗脱，得到流分Frs A1～A4。Fr A1反复经硅胶柱色谱分离得到9（308 mg）和15（202 mg）。Fr A2经硅胶、开放ODS柱分离得到5（165 mg）。Fr B经硅胶柱色谱分离，石油醚乙酸乙酯（6∶1～0∶1）洗脱，主要部分再经ODS柱纯化（甲醇水洗脱，1∶4），得到10（208 mg）和16（400 mg）。Fr C经反复硅胶柱分离，石油醚乙酸乙酯（8∶1～0∶1）洗脱，得到3（405 mg）。 Fr D经硅胶柱色谱分离，正己烷乙酸乙酯（8∶1～1∶1）洗脱，得到6（320 mg）和7（193 mg）。Fr E经Sephadex LH20（二氯甲烷甲醇，1∶1）分离得到4个流分Frs E1～E4，其中Fr E1经重结晶得到12（21 mg）；Fr E2经半制备HPLC（35%乙腈，流速30 mL・ min-1，λ=270 nm，tR =229 min，tR =381 min）得到2（29 mg）和4（31 mg）。Fr F经硅胶柱色谱分离，石油醚乙酸乙酯（8∶1～0∶1）洗脱，得到流分Frs F1～F4。Fr F1经Sephadex LH20 柱（二氯甲烷甲醇，1∶1）分离再经半制备HPLC（45% 甲醇，流速30 mL・min-1，λ=290 nm， tR =193min，tR =530 min）纯化得到13（32 mg）和14（98 mg）；Fr F2经半制备HPLC（47% 甲醇，流速30 mL・min-1，λ=270 nm， tR =188 min，tR =323 min）得到1（230 mg）和11（29 mg）；Fr F4反复经硅胶柱色谱分离，再经半制备HPLC（55% 甲醇，流速30 mL・min-1，λ=270 nm，tR=374 min）分离得到8（100 mg）。

3结构鉴定

化合物1白色粉末。HRESIMS m/z 229086 2[M-H]-，结合碳谱确定分子式C14H14O3。1H和13CNMR数据（表1）显示1个与两苯环相联的亚甲基（δH383，2H，s，CH2）和对称的1，3，4，5四取代苯环[δH 619，2H，H3，H5；δC1566（C2/6），1088（C3/5）]结构。1HNMR图谱中4个芳环质子δH 674（dd，J=80 Hz，H3′），697（m，H4′），671（m，H5′），728（dd，J=75 Hz，H6′），甲基信号δH 215（s，CH3）；13CNMR图谱中12个烯碳，1个甲基碳，1个亚甲基碳信号，综合提示化合物1为二苯基甲烷类化合物[12]。1H1HCOSY图谱显示结构中含有C3′C6′的连接关系。HMBC中，由H3到C5和C2，H7到C4和C2的相关关系，进一步确定了A环为对称的对位连甲基的四取代苯环片段（图1）。NOESY图谱显示2个苯环上的羟基有空间效应，进一步证实了该基团的连接位置（图1）。因此化合物1的结构为2，6′，2′三羟基4甲基二苯基甲烷。因Bender等在1956年化学合成了此化合物[13]，但缺少其核磁共振数据。因此为首次以天然产物的形式发现，作者提议一个通俗命名――长松萝酚（useanol），本研究首次报道其1H和13CNMR数据。

4抗炎活性

RAW2647细胞用高糖DMEM培养基（加10%胎牛血清，100 mg・L-1的青霉素和100 mg・L-1链霉素）于37 ℃在5% CO2的培养箱中培养，每天换培养液1次。实验分为对照、LPS刺激（1 mg・L-1）、姜黄素、吲哚美辛、给药组。对照组采用上述高糖DMEM补充体积，其他组用LPS（1 mg・L-1）诱导炎症，阳性药组采用姜黄素与吲哚美辛处理细胞，药物组采用多个浓度协同LPS（1 mg・L-1）处理细胞，以2× 105 mL-1接种于96孔板，每组3个复孔，刺激24 h后，吸取培养液上清（50 μL），采用Griess法测定NO浓度，酶标仪540 nm波长检测吸光度。

对化合物2，5，10外的成分进行了体外抗炎活性筛选，结果显示1，8，13对RAW2647细胞的NO生成有显著抑制活性，其IC50分别为68，39，48 μmol・L-1，阳性药姜黄素和吲哚美辛的IC50分别为153 ，429 μmol・L-1。另外，40 μmol・L-1浓度时，化合物7显示微弱的抑制效果， 8和13对细胞有轻度的杀伤作用，其他化合物视为无效。

5结果与讨论

从长松萝乙醇提取物的乙酸乙酯部位共分离得到16个化合物，包括6个缩酚类，8个多取代单苯类等。化合物15与16含有乙氧基结构，粗略一看为乙醇提取过程中的人工产物，类似的提取方式和类似的结构此前已有报道[5]，但作者未就此特别说明。然而，Nishitoba Y等以苯常温浸渍原材料，硅胶柱色谱分离，氯仿乙酸乙酯洗脱分离得到16[6]，暗示乙氧基取代成分并非提取过程中的人工产物。体外活性结果显示，部分酚酸类成分具有抗炎活性，与长松萝清热解毒的传统功效有一定的关联，但是二苯并呋喃类的松萝酸及类似物是长松萝的首要活性成分，因此对长松萝的系统基础研究需要综合酚酸类和二苯并呋喃类，从体内外的整体药效评价及药效物质层面为长松萝的临床应用提供科学依据。

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