电针对大鼠局灶脑缺血再灌注后脑内血管生长因子和血管抑制因子表达的影响

[摘要]目的：探讨电针对缺血性脑卒中的作用机制。方法：线栓法制备Wistar大鼠局灶脑缺血再灌注模型。将大鼠随机分为正常组、模型组、电针组。选取双侧“合谷”穴为电针穴位，采用原位杂交法检测血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达，免疫组化法检测血管生成素(Ang-1)和内皮抑素(Endostatin)蛋白的表达。结果：模型组VEGF mRNA、Ang－1蛋白、Endostatin蛋白的表达较正常组增加(P

[主题词] 电针；再灌注损伤／针灸疗法；血管内皮生长因子类／针灸效应；基因表达／针灸效应

文章编号：0255-2930(2007)02-0129-05

中图分类号：R246．1 文献标识码：A

脑缺血后，尽快恢复缺血区的血供，挽救濒临死亡的神经元、神经胶质细胞和血管内皮细胞，是治疗缺血性脑血管病的关键。既往较注重对神经元的研究，而对血管内皮细胞关注不够。除扩管、抗凝、溶栓等传统治疗手段外，以刺激脑内毛细血管生成的干预措施可能成为新的临床治疗手段。局灶脑缺血后，新形成的侧支血管可明显改善缺血区周围的组织灌流，血管新生可促进脑缺血后的神经功能恢复。近年研究发现，血管生长因子和血管抑制因子的动态变化共同影响脑缺血后的血管新生。本文研究局灶脑缺血再灌注及电针干预对血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素(Ang－1)、内皮抑素(En―dostatin)在大鼠脑内表达的影响，观察血管生长因子和血管抑制因子的动态变化，从新的角度阐释和理解电针的作用机理。

1材料与方法

1．1实验分组

大鼠随机分为正常组(6只)、局灶脑缺血再灌注模型组(模型组，42只)、局灶脑缺血再灌注加电针治疗组(电针组，42只)。后两组分为局灶脑缺血1h再灌注后2h、12h、24h、3d、7d、14d、21d共7个亚组，每个亚组6只。正常组不做特殊处理。1．2局灶脑缺血再灌注模型的制备

成年雄性健康Wistar大鼠90只，250～300 g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供[动物合格证编号：SCXK(渝)20020002]。线栓法制备右侧大脑中动脉局灶脑缺血再灌注模型。3．5％水合氯醛腹腔麻醉(1 mL／100 g)，大鼠仰卧位固定，经颈部正中切口依次暴露颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉颅外段。在颈外动脉残端做一环形切口，将用聚胺酯预先处理的栓子尼龙绳线，直径约0．23 mm，向颈内动脉颅内方向插入17～20 mm，遇阻力表明线栓头端已通过大脑中动脉起始部，实现缺血。1h后拔回线栓至颈外动脉的残端，实现再灌注。模型成功的判断标准：①左侧肢体疼痛回缩迟钝或不出现；②行走时向左侧偏倒或原地向左侧旋转；③提尾倒悬时左上肢不向前下伸；④右侧出现Honer氏征。

1．3 电针刺激方法及参数

电针组：参照中国针灸学会实验针灸委员会实验动物穴位图谱，选取双侧“合谷”穴(LI 4)为电针穴位。局灶脑缺血后45 min，电针刺激上述穴位。每次电针时间为15 min。对超过Id的时相点，每日电针1次，最多电针7d，7d后自然喂养，不做特殊处理。刺激参数：疏密波F1=40 Hz，F2=60 Hz，空载输出电压1．5 V。

1．4取材

每组动物到达相对应时相点时，大鼠麻醉后用生理盐水200 mL快速左心室灌注冲洗，再用4％多聚甲醛(加0．1％的DEPC)500 mL先快后慢灌注固定，断头取脑，制备石蜡切片，以缺血区周围为观察部位，取相邻切片分别用于原位杂交、免疫组化检测。

1．5 VEGF mRNA原位杂交检测

采用VEGF mRNA原位杂交试剂盒(武汉博士德公司)。杂交前处理：切片脱蜡至水，3％柠檬酸一胃蛋白酶液处理切片3 min，1％多聚甲醛(pH7．4的0．1 mol／L PBS配制，加0．1％的DEPC)后固定。杂交：滴加预杂交液，39℃预杂交6h，滴加适量的杂交液，盖上原位杂交盖玻片41℃过夜。杂交后洗涤：分别用2×SSC、0．5×SSC、0．2×SSC洗涤。依次滴加封闭液、生物素化鼠抗地高辛抗体、SABC、生物素化过氧化物酶。DAB显色、脱水、透明、封片。

1．6 Ang一1和Endostatin蛋白免疫组化检测

切片脱蜡至水，抗原热修复92～98℃15 min，滴加封闭液，分别滴加1：100兔抗大鼠Ang一1抗体(武汉博士德公司)和1：100兔抗大鼠Endosta―tin抗体(武汉博士德公司)，4℃过夜，滴加SABC。DAB显色、脱水、透明、封片。

1．7结果判定和统计学处理

阳性细胞计数：在×400视野下计数，以胞浆染成棕黄色为阳性细胞，每只动物随机选取3张非连续切片，每张切片取10个不连续视野的均值。每组数据用　±s表示，用Excel软件进行t检验，以P

2 结果

2．1 VEGF mRNA原位杂交

正常组：皮质、内囊、海马等部位可见少许阳性细胞表达。模型组(见图1)：VEGF mRNA表达在再灌注后2 h明显增加(P

2．2 Ang－1蛋白免疫组化

正常组：脑组织中几乎没有阳性细胞表达。模型组(见图3)：Ang－1蛋白在再灌注后2 h、12 h和正常组没有差异(P>O．05)，但再灌注后24 h观察到Ang－1蛋白升高(P

较，再灌注后2 h明显增加(P

2．3 Endostatin蛋白免疫组化

正常组：海马和纹状体等部位有少量Endosta―tin蛋白表达。模型组(见图5)：Endostatin蛋白表达在再灌注后2 h增加(P

3　讨论

3．1血管生长因子的表达

脑缺血后的血管新生可被一系列血管生长因子和血管抑制因子调节。血管生成生长因子具有正性调控作用，包括内皮细胞特异性的VEGF家族、Ang家族等。它们相互联系，共同调节血管生成的各个环节。VEGF／VEGFR系统可能在启动血管新生中发挥关键性作用，是整个脑缺血后血管新生调控的中心环节。VEGF是内皮细胞特异性的促有丝分裂原和趋化因子。本实验中，脑缺血后血管生长因子表达增加，VEGF mRNA在再灌注后2h即开始增加，24 h达高峰，并持续到14d仍有显著性差异。Ang－1蛋白在再灌注后24h才开始增高，延迟到14d到达高峰，21d仍未回到正常组水平。提示VEGF可能主要在脑缺血的早、中期发挥作用，而Ang－1主要在中、晚期发挥作用，两者的作用在时相上有交叉、重叠。Ang系统与VEGF系统相互补充和协调，Ang－1的活性在VEGF发挥作用后才开始增强，增加血管分支和重塑，促进血管成熟与稳定。VEGF与Ang－1的表达时间差异，可能是脑缺血早期VEGF激活内源性血管新生过程，引起血管通透性增加，血脑屏障(BBB)功能破坏，而Ang－1对新生内皮的迁移有抑制作用，介导血管成熟，防止BBB过度破坏。

在电针组中，再灌注后2 hVEGF mRNA比模型组增加，24 h达高峰，直到14d仍有统计学意义，提示电针组VEGF mRNA较模型组升高更为明显和持久。Ang－1蛋白电针组在再灌注后2h即比正常组增加，和模型组相比，Ang－1蛋白再灌注后2h开始增加，14d达高峰，21d仍有显著性差异。提示电针组Ang－1蛋白增加比模型组更早、更显著。既往实验对局灶脑缺血再灌注研究多集中在早期，本实验将时间点延长到21d，更加全面地反映了血管生长因子的表达时程。电针刺激最多只有7d，但21d血管生长因子的表达仍较模型组增高，提示电针治疗效果持续时间较长。

本实验观察到VEGF和Ang－1表达部位主要在缺血区周围，且神经细胞和血管内皮细胞都有表达。这些结果提示，血管生长因子可能同时作用于神经细胞和血管内皮细胞，介导神经和血管的相互作用，在脑缺血后的神经系统和血管系统的修复重建过程中发挥重要的桥梁和纽带作用。“神经血管单元”由神经细胞、血管内皮细胞、星形胶质细胞三类主要细胞及其位于它们周围的维持大脑组织完整性的细胞外基质组成，在脑缺血后作为一个整体来综合考虑。这个概念强调细胞与细胞之间、细胞与基质之间的相互作用和动态平衡，以动态的观点全面反映脑缺血后的病理生理过程。VEGF和Ang－1的作用是否与“神经血管单元”有关，电针刺激对“神经血管单元”又有怎样的影响，它们的作用机制如何，这还需要进一步的探索。

3．2血管抑制因子的表达

既往，脑缺血后血管新生的研究较注重血管生长因子，而对血管抑制因子关注不够。血管抑制因子包括内皮抑素(Endostatin)、血管抑素(Angiosta―tin)等，具有负性调控效应，拮抗血管生长因子的作用。Endostatin多途径诱导内皮细胞凋亡，抑制内皮增生、迁移，阻断VEGF受体活化等。血管新生能力的强弱取决于这两者之间的动态平衡，调控这两者的平衡有助于促进或抑制血管生长。目前Endostatin多用于抑制肿瘤生长的研究，尚无En―dostatin在脑缺血后表达的报道。本实验中，血管抑制因子表达在脑缺血后2h增加，并有统计学意义，在12h达高峰，与内皮细胞凋亡的时间基本吻合，而在7d差异即没有显著性意义。Endostatin在早期(

电针组：Endostatin蛋白的表达在再灌注后24 h内升高，但较模型组明显被抑制，差异有显著性意义，3 d后仍然可见其表达降低的趋势，但与模型组比较，差异无显著性意义。提示电针可以显著降低血管抑制因子的早期表达，而晚期效果不明显。

3．3 电针与血管生长因子、血管抑制因子

既往研究表明，电针“百会”“水沟”穴可以促进脑缺血后血管生长因子表达，促进血管新生和神经功能恢复。作为具有代表性的传统的非药物治疗方法，针刺具有“整体的良性双向调节”作用。电针促进脑缺血后血管新生可能与“双向调节”血管因子的表达有关，即上调血管生长因子和下调血管抑制因子。本实验观察到，电针后一方面血管生长因子的表达增加；另一方面血管抑制因子的表达被抑制。电针对脑缺血可发挥多环节、多水平、多层次、多途径的调节作用，有利于全面促进整个脑缺血后的血管新生。现在对治疗性血管新生(therapeuticangiogenesis)常通过相应的重组蛋白或基因导入缺血组织中增强缺血区的侧支毛细血管新生。这种外源性“补充”机制可以直接弥补血管生长因子的不足，但不容易调控，过少和过量都不可能达到有效的治疗作用。而电针激活内源性的血管新生，可能有助于实现精确、适时、适量的调控，发挥较佳的血管效应。

(收稿日期：2006-02-05，齐淑兰发稿)

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