SRC―1对异位内膜雌激素调控的CXCL12表达的影响

[摘要] 目的 研究子宫内膜异位症患者的异位内膜中类固醇激素受体辅活化子-1（SRC-1）和趋化因子配体12（CXCL12）的表达水平，从而了解SRC-1对异位子宫内膜雌激素（E2）调控的CXCL12表达的影响。方法 2014年9月―2016年9月，方便选择在苏州大学附属第一医院妇科因内异症接受手术治疗，术后标本证实为内异症的15例患者的异位内膜及同期放置宫内节育器的无内异症且月经周期正常的健康妇女10名的正常内膜，应用实时荧光定量RT-PCR方法比较正常子宫内膜和异位子宫内膜在月经的增生期和分泌期SRC-1和CXCL12mRNA表达水平。ELISA检测沉默异位内膜SRC-1的表达对雌激素诱导异位内膜基质细胞表达CXCL12的影响。结果 正常子宫内膜基质细胞中SRC-1和CXCL12的表达呈现周期性变化，而异位内膜这两种因子的表达并没有周期性的改变。异位内膜SRC-1和CXCL12mRNA的表达与正常内膜相比明显升高。沉默异位内膜SRC-1表达后，E2诱导的CXCL12表达下降50.04%（P

[关键词] 甾体激素受体辅活化子-1；趋化因子配体12；子宫内膜异位症

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2016）12（c）-0034-03

[Abstract] Objective To observe the expression of steroid coactivator-1（SRC-1） and steroid-induced CXCL12 in endometriosis （EMS） and to explore the roles of SRC-1in the steroid-induced CXCL12 expression in EMS. Methods Convenient selection from September 2014 to September 2016，15 endometriosis cases undergoing surgery in The First Affiliated Hospital of Soochow University were enrolled in this study.Their ectopic endometriosis were from ovarian endometriomata which were identified pathologically. The 10 normal endometrium were acquired from the healthy women with normal cycle. Quantitative real-time polymerase chain reaction was used to quantify the mRNA levels of SRC-1 and CXCL12 during the menstrual cycle. ELISA was adopted to analyze the steroids-induced CXCL12 expression before and after the SRC-1 was silenced by siRNA. Results The SRC-1 and CXCL12 showed marked cyclic differences in normal endometrium. There were no periodic variation in the expression of SRC-1and CXCL12 in ectopic endometrium throughout the menstrual cycle. The SRC-1 and CXCL12 of ectopic endometrium were significantly higher than that of normal endometrium. Silencing of SRC-1 significantly reduced the E2-induced CXCL12 expression to 50.04%（P

[Key words] Steroid receptor coactivator -1； Chemokine ligand 12； Endometriosis of uterus

化因子配体12（CXCL12）是趋化因子家族成员之一，它通过和受体CXCR4结合，激活MAPK信号通路，可以促进胚胎发育，血管形成以及肿瘤的生长和远处转移[1]。CXCL12是雌激素调节基因，雌激素（E2）可以使子宫内膜基质细胞中CXCL12的表达升高[2]。Ruiz等[3]实验研究表明内异症患者CXCL12和CXCR4呈现高表达。类固醇激素受体辅活化子-1（SRC-1）是SRCs家族成员之一[4]，它可以增强许多核受体的转录活性，包括雌激素受体和孕激素受体。该实验自2014年9月―2016年9月，方便选择在苏州大学附属第一医院妇科因内异症接受手术治疗，术后标本证实为内异症的15例患者的异位内膜及同期放置宫内节育器的无内异症且月经周期正常的健康妇女10名的正常内膜，采用RT-PCR方法，比较正常子宫内膜和异位子宫内膜中SRC-1和CXCL12的mRNA表达；通过siRNA沉默异位内膜SRC-1的表达，研究SRC-1对异位内膜雌激素调控的CXCL12表达的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 标本来源 异位子宫内膜取自于苏大附一院妇产科15例EMS病人，均因卵巢子宫内膜异位囊肿行手术治疗，标本经病理检查证实为子宫内膜异位症。正常子宫内膜取自无EMS病史行取环或上环的月经周期正常的健康妇女，病理检查证实为正常的子宫内膜。其中增生（P）期内膜取自月经第5～14天，分泌（S）期内膜取自月经第15～28天。15例患者中增生期8例，分泌期7例。7例分泌期内膜标本全部用于分离异位内膜基质细胞，其中成功用于实验者为5例。

1.1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒，逆转录试剂盒，17β-雌二醇（17β-E2，CXCL12ELISA试剂盒，二喹啉甲酸（BCA）试剂盒，抗SRC-1抗体，SRC-1的siRNA。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR技术检测SRC-1和CXCL12的表达 SRC-1和CXCL12的引物根据GenBank中的mRNA序列采用Oligo 5.0软件进行设计，上海生工生物技术有限公司合成。引物序列见表1。RNA提取及逆转录参照试剂盒说明书进行。定量PCR反应采用Power SYBR Green PCR试剂盒，7700型实时荧光定量PCR仪进行扩增和检测。根据公式2-ΔΔCT计算目的基因与内参基因GAPDH的相对表达量。

1.2.2 细胞培养 原代细胞传代到6孔板，传代后的细胞达到80%汇片时，换用含有10～8 mol/L 17β-E2培养液继续培养。分别于培养24、48、72、96 h后收集上清，采用ELISA法检测上清中CXCL12的表达量。研究沉默SRC-1表达对雌激素诱导的CXCL12表达的影响，将异位内膜基质细胞以1×105/孔的密度传至6孔板。Opti-MEM培养过夜，脂质体2 000介导SRC-1的siRNA（简称siSRC-1）转染异位内膜基质细胞，终浓度为每孔100 nmol/L。转染4 h后换用完全培养液培养，2 d后换用含有10-8 mol/L 17β-E2的培养液继续培养3 d。

1.2.3 CXCL12酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组SDF-1α的表达水平：在E2作用后的24、48 h和72 h，分别收集上清用ELISA试剂盒检测上清液中CXCL12的表达水平。

1.2.4 Western-Blot检测转染前后SRC-1蛋白表达水平 异位内膜基质细胞转染siSRC-1后48 h抽提胞白，BCA试剂盒检测蛋白浓度。SDS-PAGE分离蛋白，封闭液室温孵育1 h，单克隆一抗4℃过夜，辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗室温孵育1 h。采用ECL+PLUS试剂（Amersham Pharmacia Biotech）检测特异蛋白条带的显色。实验中的一抗分别为抗SRC-1抗体和内参蛋白PARP一抗抗体。

1.3 统计方法

数据采用SPSS 13.0统计软件进行处理与分析，文中数据以均数±标准误（x±s）表示，实验至少重复3遍。组间比较采用单因素方差分析，P

2 结果

2.1 内异症患者的异位子宫内膜和正常子宫内膜基质细胞中SRC-1和CXCL12的表达水平

实时定量PCR结果显示，正常内膜中SRC-1和CXCL12的表达具有周期性变化。S期表达水平分别为（2.64±1.02）和（1.62±0.50），均显著低于P期。而异位内膜中SRC-1和CXCL12的表达没有这种周期性改变（P>0.05）。异位内膜S期SRC-1表达水平为（5.44±1.27），正常内膜S期SRC-1表达水平为（2.64±1.0），二者相比差异有统计学意义，见表2。

2.2 雌激素对于异位子宫内膜基质细胞SDF-1表达的影响

在表2中观察到S期异位内膜SRC-1和CXCL12表达均高于正常内膜，因此在以后的实验中选取了S期的异位内膜基质细胞来观察类固醇激素对SDF-1表达的影响。结果如图1所示，与对照组比较，10-8 mol/L E2显著增加CXCL12的表达。

3 讨论

子宫内膜异位症是指子宫饶ぷ橹（腺体和间质）出现在子宫体以外的部位。异位内膜可以侵犯全身任何部位，但绝大多数位于盆腔脏器和壁腹膜，以卵巢和宫骶韧带最常见，其次为子宫及其他脏腹膜，阴道直肠膈等部位。由于内异症是雌激素依赖性疾病[5]，在自然绝经和人工绝经后，异位内膜病灶可逐渐萎缩吸收，使用性激素抑制卵巢功能，可暂时阻止疾病发展[6]。可见雌激素在内异症的发生发展中起重要作用。

CXCL12通过和受体CXCR4结合，可以促进胚胎发育，血管形成以及肿瘤的生长和远处转移。Hall JM等[7]试验研究表明，在卵巢组织中，尤其是内异症组织中，CXCL12/CXCR4表达明显增多，与该研究结果相一致。此外，CXCL12是雌激素调节基因，雌激素（E2）可以使子宫内膜基质细胞中CXCL12的表达升高，所以内异症患者中高雌激素水平导致CXCL12呈现高表达。

类固醇激素受体辅激活子家族（SRCs）是一类相对分子质量约为160×103的辅激活因子，包括3个同系成员SRC-1，SRC-2，SRC-3。SRC蛋白家族主要对类固醇受体如雌激素受体、孕激素受体、甲状腺素受体以及糖皮质激素受体等发挥转录调节作用， 对机体的生长、发育以及生殖产生重要的影响[8]。

研究结果显示，雌激素诱导的CXCL12表达水平为（2313±357）ng/L，显著高于雌激素培养前的（614±130）ng/L，说明雌激素可使异位内膜基质细胞中CXCL12表达增加，这与Tsutsumi等[2]对正常子宫内膜的研究结果一致。沉默异位内膜基质细胞中SRC-1表达后，雌激素诱导异位内膜基质细胞表达CXCL12的水平为（1155±244）ng/L，较SRC-1沉默前的表达水平下降50.04%（P

[⒖嘉南]

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（收稿日期：2016-10-26）