卵巢癌患者exosomes来源初探

作者：李奇灵 孙阳珍 于月成 方静 张媛丽 辛晓燕

【关键词】 exosomes；腹水；卵巢肿瘤；细胞培养技术

Comparison of extraction methods of exosomes from patients with ovarian cancer

【Abstract】 AIM: To compare the extraction methods of exosomes from tissue or ascites of an advanced ovarian cancer patient, to detect the expression of exosomes of two source, and to explore the best pathway of acquiring exosomes. METHODS: The tissue of ovarian cancer was taken and the cancer cells were separated and cultured. The cell culture supernatant was collected. The ascites was collected from the same patient. The exosomes were extracted by ultracentrifugation and ultrafiltration from the cell culture supernatant and the ascites and were examined under electron microscope. HSP70, HSP90, MHC class Ⅰ molecule and MHC class Ⅱ molecule on exosomes were tested by Western blotting. The protein concentration of exosomes was tested by BCA method. RESULTS: The time for the centrifugation of ascites was longer than that of supernatant. The exosomes could be obtained from all of the supernatants and the ascites with cancer cells, not from the ascites without cancer cells. The exosomes expressed MHC class Ⅰ molecule, HSP70 and HSP90 except MHC class Ⅱ molecule. The protein concentration of exosomes in the ascites was higher than that of the supernantant of cell culture (P<0.05). CONCLUSION: Ascites is a better source of exosomes for the ovarian cancer patient with malignant effusion with positive cancer cells. The exosomes can be extracted from ovarian cancer tissue for the patients without ascites or with ascites in which cancer cells are negative.

【Keywords】exosomes; ascites; ovarian neoplasms; cell culture techniques

【摘要】目的： 同一晚期卵巢癌患者，对组织来源和腹水来源的exosomes进行方法和数量的比较，探讨获得卵巢癌患者exosomes的最佳途径. 方法： 收集晚期卵巢癌患者卵巢癌组织，分离癌细胞进行培养，留上清液，取同一患者的腹水，通过超速离心和超滤等方法提取上清液及腹水中的exosomes,电镜下检测；Western Blot测定exosomes 上HSP70, HSP90, MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子的表达；用BCA蛋白测定法测定exosomes的蛋白浓度,计算蛋白总含量. 结果： 腹水离心时间比上清液离心时间长，所有细胞培养上清液和癌细胞阳性的腹水均能分离出exosomes，癌细胞阴性的腹水中未分离出exosomes；两种来源的exosomes共同表达MHCⅠ类分子、HSP70和HSP90，均不表达MHCⅡ类分子，腹水中分离出来的exosomes蛋白含量比细胞培养上清液的含量高（P<0.05）. 结论： 腹水中癌细胞阳性的患者，腹水是exosomes的比较理想的来源；无腹水或腹水中癌细胞阴性的患者，exosomes可来源于卵巢癌组织.

【关键词】 exosomes；腹水；卵巢肿瘤；细胞培养技术

0引言

exosomes是许多种细胞都能分泌的直径30～90 nm的小囊泡，由蛋白质和脂质组成的亚细胞器. 近年来，癌症患者的肿瘤细胞和树突状细胞（dendritic cell, DC）分泌的exosomes，由于它携带所分泌细胞的一些抗原信息，被作为肿瘤特异性抗原的来源，用于恶性肿瘤免疫治疗［1-2］的研究. 由DC分泌的exosomes已经在黑色素瘤和非小细胞肺癌进入了临床Ⅰ期试验［3］, 但exosomes在卵巢癌中的研究进展较慢. 本研究我们对晚期卵巢癌患者组织来源和腹水来源的exosomes分离方法、获得量比较，探讨卵巢癌患者最佳exosomes来源途径.

1对象和方法

1.1对象选择200501/200512在西安交通大学第一附属医院妇产科住院的原发性卵巢癌患者15例，年龄（53±6）岁. 临床分期Ⅲ～Ⅳ期，均伴有腹水，腹水中查出癌细胞者10例(10/15)，腹水中癌细胞阴性者5例(5/15). 取标本前未经化疗，均为第一次剖腹探查，术中无菌操作留取卵巢癌组织，术前或术中留取腹水. 术后病理诊断，浆液性囊腺癌9例，黏液性囊腺癌6例.

99.93%重水购自Sigma公司；RPMI1640培养液购自Gibco公司； Centriplus离心超滤管（100KDa）、Amicon Ultra高回收率高流速切向流超滤离心管（100KDa）购自美国Millipore公司；兔抗人热休克蛋白（HSP70）多克隆抗体、兔抗人HSP90多克隆抗体购自武汉博士德生物工程公司；鼠抗人MHCⅠ类分子(HLAABC)mAb、鼠抗人MHCⅡ类分子（HLADR）mAb购自华美公司；Western Blot试剂盒（包括酶标记二抗、A液和B液）购自Pierce公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒，购自碧云天生物技术研究所.

1.2方法

1.2.1细胞培养采用机械分散法获得肿瘤细胞悬液：将肿瘤组织剪成5～10 mm3的小块组织，弃去结缔组织、坏死组织、血管等. 轻轻挤压肿瘤组织过100目的筛网，悬液再过200目筛网，将所得的细胞悬液置于含2 mmol/L L谷氨酰胺和青霉素1×105 U/L、链霉素100 mg/L的无血清RPMI1640全培养液中，于37℃含50 mL/L CO2细胞培养箱中常规培养，隔日传代,待细胞生长至对数期时，收集上清液. 用25 g/L胰酶消化收集细胞，用PBS洗涤重悬，调整细胞浓度为1×1010/L. 实验均用对数生长期的细胞.

1.2.2exosomes的获得分别取腹水和细胞培养上清液，以300 g离心5 min，取上清液；以800 g离心30 min，去沉淀；再以10 000 g离心40 min，取上清液；加入Centriplus超滤离心管中，以1500 g离心1 h，取浓缩液. 将30 g/L的蔗糖/重水垫、浓缩液和10 mmol/L PBS依次放入离心管中，低温下以100 000 g超速离心1 h. 取出混有exosomes的蔗糖/重水垫,10 mmol/L PBS悬浮，加入Amicon Ultra高回收率高流速切向流超滤离心管中,以1500 g离心30 min，重复3次. 取浓缩液用10 mmol/L PBS悬浮成5 mL，为待测液. 记录离心和超滤次数，置于4℃冰箱中保存备用.

1.2.3exosomes的鉴定

1.2.3.1电镜将待测液各取20 μL滴于载样铜网上，于室温静置1 min；用滤纸从侧面吸干液体，滴加20 g/L磷钨酸（pH 6.8）约30 μL于铜网上，室温负染1 min；用滤纸吸干负染液，在白炽灯下烤干后，于透射电镜下观察，并照相.

1.2.3.2Western Blot方法① 灌制SDSPAGE电泳胶（6%浓缩胶，12%分离胶）；② 用细胞培养上清液中exosomes阳性的待测液、腹水中exosomes阳性的待测液、癌细胞裂解液和腹水中exosomes阴性的待测液各15 μL，上样于四块PAGE凝胶的对称位置，恒压100 V电泳，至溴芬蓝带泳至胶底以上约1 cm处，终止电泳；③ 用电转移装置将蛋白转至NC膜上；④ 电泳转移完毕后，取出膜，用TBS洗涤1次；⑤ 将膜放入封闭液，室温下封闭1 h，或4℃封闭过夜；⑥ 用封闭液稀释各抗体上清（HSP70 1∶50；HSP90 1∶50；MHCⅠ 1∶100； MHC Ⅱ 1∶100），与含有目的蛋白条带的膜在室温下作用1 h；⑦ TBST洗膜4次，每次15 min；⑧ 按试剂盒说明稀释酶（HRP）标记二抗，与膜室温下作用30 min；⑨ TBST洗膜4次，每次15 min；⑩ 按试剂盒说明混合A液和B液，与膜作用1 min后进行X光片曝光；显影和定影后观察结果.

1.2.4exosomes浓度测定取腹水和细胞培养上清液中exosomes阳性的待测液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒分别测定的蛋白浓度，步骤如下：① 按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50∶1）配制适量BCA工作液，充分混匀. ② 完全溶解蛋白标准品，取10 μL用PBS稀释至100 μL ，使终浓度为0.5 g/L. ③ 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 μL加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20 μL. ④ 加10 μL样品到96孔板的样品空中，加标准品稀释液到20 μL. ⑤ 各孔加入200 μL BCA工作液，37℃放置30 min. ⑥ 测定A562 nm值，根据标准曲线计算出蛋白浓度.

统计学处理： 统计学处理采用SPSS10.0统计软件包分析,两组之间均数比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义.

2结果

2.1离心及超滤过程的比较腹水标本与细胞培养上清液标本离心次数相同，而超滤次数多于细胞培养上清液，腹水标本超滤慢，时间长，100 mL标本需要(70±9)min，易堵塞超滤管的超滤孔；而细胞培养上清液则需要(20±7)min，两者相比有显著性差异(P<0.05), 相对腹水标本而言，从细胞培养上清液中分离exosomes可节省时间和超滤管.

2.2电镜分别将两种标本置于透射电子显微镜下观察，可见具有明显异质性的圆形或椭圆形小囊泡，直径约30～90 nm，有完整的包膜，内为低电子密度物质（图1）. 10例晚期卵巢癌患者癌细胞阳性腹水标本和15例细胞培养上清液中，均能分离出exosomes, 电镜下形态无区别. 5例晚期卵巢癌患者癌细胞阴性腹水标本中未分离出exosomes.

图1电镜下人晚期卵巢癌患者来源的exosomes　略

2.3免疫蛋白的表达在细胞培养上清exosomes阳性待测液、腹水中exosomes阳性的待测液、癌细胞裂解液标本中发现大约在Mr(×103)为90，35和73处有一明显的特异蛋白带，通过Western Bolt检测后，该蛋白带可被HSP90, MHCⅠ类分子抗体和HSP70抗体特异性识别（图2），从而肯定其为HSP90, MHCⅠ类分子和HSP70基因的蛋白表达产物. 在Mr(×103)为40处无蛋白带表达，故无MHCⅡ类分子表达. 腹水中exosomes阴性的待测液中无蛋白表达.

图2HSP70, HSP90和MHCⅠ类分子的Western Blot表达情况　略

2.4腹水及细胞培养上清液中分离exosomes的各种参数（表1和表2）蛋白总量(mg)=最终体积（mL）×BCA法测的蛋白浓度(g/L). 腹水来源标本：平均每个患者的exosomes蛋白总量为（3.27±1.44）mg. 组织来源标本的exosomes蛋白总量为（0.77±0.40）mg，与腹水来源标本蛋白含量（3.27±1.44）mg相比，P=0.00, P<0.01，有显著性差异.

表1晚期卵巢癌10例患者癌细胞阳性的腹水中分离的exosomes参数　略

表2晚期卵巢癌15例患者组织来源的exosomes参数　略

3讨论

经研究证实exosomes来源于细胞内的多囊体, 多囊体内的富含肽段MHC分子的小泡被释放到细胞间隙中，形成所谓的exosomes. 在鼠实验中，DC来源的exosomes显示了具有免疫原性的特征，可以消除肿瘤,表明exosomes是具有生物活性的囊泡，具有免疫调节作用和潜在的抗肿瘤作用［4］. 面向临床应用的GMP级外来体的制备和纯化程序,即通过一系列标准离心和超滤的方法分离exosomes,用电镜鉴定其形态和直径，Western Blot或免疫电镜方法证明其上表达细胞膜成分，目前已用于肿瘤免疫治疗，其来源包括肿瘤细胞来源，DC来源以及恶性浆液［5-7］.

本研究我们利用标准方法制备exosomes，从10例癌细胞阳性的卵巢癌患者腹水和15例组织来源的细胞培养上清液中分离出了exosoems，用电镜证实了其形态. 我们发现对同一卵巢癌患者肿瘤细胞培养上清液和腹水来源的exosomes进行了比较，发现从细胞培养上清液和腹水中分离的exosomes与腹水中的癌细胞裂解液表达相同的免疫原性蛋白分子HSP70、HSP90和MHCⅠ类分子，这些与肿瘤密切相关的分子表明腹水和细胞培养上清液中exosomes均来源于卵巢癌细胞. 有学者研究发现，肿瘤来源的exosomes除了含有携带高浓度的肿瘤抗原候选分子、抗原提呈分子及其伴侣分子外，还含有四次跨膜蛋白，GPI锚定蛋白等［8］. Bard等［9］从4例间皮瘤、2例肺癌、2例乳腺癌和1例卵巢癌的胸水中分离出外来体，其上包含有特异性抗原：SNX25, BTG, PEDF, thrombospondin2. 卵巢癌患者的腹水来源的exosomes所携带的抗原信息可能也是很丰富的，需要进一步证实.

每次抽腹水可获得930～2100 mL，其内含有exosomes蛋白总量为（3.27±1.44）mg，而经过10余次的细胞培养传代，可获得细胞培养上清液100 mL,获得exosomes的蛋白总量为（0.77±0.40）mg，明显少于腹水来源的exosomes. 所以对于腹水中癌细胞阳性的患者而言,腹水是exosomes的理想来源，不但量丰富，而且采集方法简单、痛苦小，可直接分离. 相对于体外培养细胞上清而言，腹水来源的exosomes具有几个优势： ① 可以大量制备，免除了繁琐的细胞培养. ② 电镜结果证实腹水中含有大量的大小不一的exosomes. ③ exosomes上的HSP70, HSP90和MHCⅠ类分子为相关性最密切的肿瘤抗原，这些是被自身抗原呈递细胞摄取和呈递的关键分子. ④ exosomes表达HSP70, HSP90和MHCⅠ类分子，这些本源性肿瘤抗原表明这些exosomes是来自于肿瘤细胞. Andre等用抗MHCⅠ类分子ABC mAb进行的免疫吸附试验证实每毫升恶性积液中平均含有8×1010个exosomes性MHCⅠ分子，而体外培养的肿瘤细胞上清约为每毫升7×109个exosomes性MHCⅠ分子. 所有这些数据说明恶性积液是肿瘤细胞源性exosomes的丰富来源，而且其上的肿瘤抗原/MHCⅠ复合物非常适合临床应用.

本研究虽然发现对于同一卵巢癌患者来说，在分离方法和获得量上比较，从癌细胞阳性的腹水中获得exosomes比细胞培养理想，但哪一种来源的exosomes在免疫治疗中会发挥更大的作用需进一步研究.

【参考文献】

［1］Delcayre A, Estelles A, Sperinde J, et al. Exosome display technology: Applications to the development of new diagnostics and therapeutics ［J］. Blood Cells Mol Dis, 2005,35(2):158-168.

［2］牟丹蕾，贾战生，白雪帆. 胞体外免疫治疗中的“特洛伊木马”［J］. 生理科学进展, 2005,36(2):113-118.

［3］Delcayre A, Le Pecq JB. Exosomes as novel therapeutic nanodevices［J］. Curr Opin Mol Ther, 2006,8(1):31-38.

［4］Chaput N, Taieb J, Andre F, et al. The potential of exosomes in immunotherapy ［J］. Expert Opin Biol Ther, 2005,5(6):737-747.

［5］ Bu N, Li QL, Sun BZ, et al. Antileukaemia activity of cord blood cytotoxic T lymphocytes induced by CMLderived exosomes［J］. Haema, 2006,9(2):222-229.

［6］Chaput N, Taieb J, Schartz NE, et al. Exosomebased immunotherapy［J］. Cancer Immunol Immunother, 2004,53(3):234-239.

［7］ 白俊，任军，王均，等. 离心过滤法提取外切体的实验研究［J］. 第四军医大学学报，2004,25（10）：890-892.

［8］ Mignot G, Roux S, Thery C, et al. Prospects for exosomes in immunotherapy of cancer［J］. J Cell Mol Med, 2006,10(2):376-388.

［9］Bard MP, Hegmans JP, Hemmes A, et al. Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions［J］. Am J Respir Cell Mol Biol, 2004,31(1):114-121.