高浓度槲皮素对G6PD缺乏者体外红细胞的影响

[摘要] 目的 研究高浓度槲皮素对G6PD缺乏者体外红细胞的影响。 方法 选取G6PD活性正常、缺乏的检验者各50例，采集外周血并与槲皮素孵育，测定红细胞的GSH、MetHb，并对红细胞的形态学变化进行观察，考察槲皮素对G6PD活性缺乏者红细胞影响。 结果 槲皮素对G6PD缺乏者红细胞具有明显的氧化作用，GSH呈下降趋势，而MetHb则显著上升（P

[关键词] 高浓度槲皮素；G6PD缺乏；红细胞

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）02-0017-03

G6PD缺乏者指酶活性因X染色体中G6PD基因改变而出现不同程度的遗传性疾病，主要表现为溶血性贫血与新生儿黄疸，氧化性药物等众多因素均可能为其诱因[1]，黄酮类化合物通常有抗氧化活性，可放置活性自由基对机体造成损伤，但使用不当仍可能导致患者出现不同程度的活性自由基损害及细胞凋亡[2]。本次研究针对高浓度槲皮素对G6PD缺乏者红细胞的影响进行研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究入选的100例受检者均为男性，在2010年10月～2014年3月在我院接受招募，年龄18～60岁，平均（30.54±7.46）岁，根据G6PD活性分为G6PD活性正常组与G6PD缺乏组，两组均为50例，正常组活性≥6.70/gHb，缺乏组0.05），具有可比性。

1.2 纳入标准

①男性；②血常规、肝肾功能及体格检查正常；③无抽烟、嗜酒等不良嗜好；④4个月内未发生感染性疾病或溶血疾病；⑤两周内未服用药物；⑥无其他血液系统疾病；⑦对试验知情并自愿配合完成试验。所有患者行血常规、肝肾功能检查，抽取外周静脉血20 mL，同时测定G6PD活性与体外活性孵育试验，上述检查及试验均在采取后12 h内完成。研究方案报医院伦理委员会审批通过。

1.3 仪器及药物

仪器包括全自动生化分析仪、紫外可见分光光度计、高速冷冻离心机、水浴恒温振荡器、全自动血细胞分析仪。药物于中检所采购槲皮素与α-萘酚，使用二甲基亚砜将槲皮素配置为1、5、100 mol・L-1浓度的储备液，α-萘酚使用二甲基亚砜配置为0.4 mg・mL-1储备液。使用5 mmol・L-1PBS（5 mmol・L-1葡萄糖，140 mmol・L-1氯化钠，pH7.4稀释）对储备液进行稀释处理，浓度为50%。

1.4 方法

1.4.1 G6PD活性测定 利用7170A全自动生化分析仪对G6PD活性进行测定（连续监测速率法）。通过离心机将EDTA-K2抗凝血5 min离心处理，离心参数为4 000 r/min，避免血浆层干扰吸取20 μL压积红细胞，并将其放入1mL溶解液中溶解，待1～2 min红细胞完全溶解后进行测定。参数设定：1、2试剂分别为220 μL、25 μL；试验温度37°C；主波长及副波长分别为340 nm、660 nm；反应时间10min；设置209084为计算因数。以U/L表示结果，后以全自动血细胞分析仪对Hb进行测定，进样量200 μL取EDTA-K2抗凝血2 mL，最后G6PD活性=G6PD（U/L）/Hb（g/L），并以U/gHb表示结果。

1.4.2 红细胞孵育 离心全血后分离血浆与白细胞层，压积红用4℃等渗PBS洗涤，洗涤三次后再次将40%体积悬浮于PBS中，制备40%红细胞悬液，加入懈皮素，浓度控制在50、250、500 μmol・L-1三个梯度。分别对应低、中、高组，另外设立α-萘酚组（0.02 mg・mL-1）、DMSO组（5%）和PBS组，在37℃水浴中放置孵育管，并振荡孵育2 h。剩下的全血和药物进行孵育，相关设置同上。

1.4.3 GSH测定 还原性谷胱甘肽用比色法测定，将孵育完成后的血样离心处理（10 min，2000 r），将30 μL红细胞放置在720 μL蒸馏水中制备溶血液。将300 μL溶血液与1.2 mL GSH试剂混匀后高速离心，后抽取上清液1 mL进行显色反应，与420 nm处对吸光度进行测定，另外对标准管吸光度和空白管吸光度进行测定，最后计算处GSH含量，公式为GSH=测定管吸光度-空白管吸光度）/（标准管吸光度-空白管吸光度）×20×307×125/104。

1.4.4 MetHb检测 MetHb即高铁血红蛋白，其含量结合630 nm处吸光度的差值，观察其和Hb转化为MetHb的比值，用蒸馏水将上述制备溶血液300 μL用闭稀释为2.55 mL并混匀，将蒸馏水作为空白，在630 nm处测定吸光度A1；加入50 μL氰化钾溶液，于上述相同波长条件下测定A2。后抽取100 μL溶血液蒸馏水稀释至2.5 mL，将50 mL高铁氰化钠加入，同在630 nm处测定吸光度A3，另加入50 μL测定吸光度A4。利用（A1-A2）/（A3-A4）×100%公式将（MetHb）%计算出来。

1.5 统计学方法

应用SPSS13.0统计学软件进行数据分析。两组受试者间的比较采用Student’s t-test。两组受试者各药物组与相应对照组的比较分别采用随机区组的方差分析，并进行两两之间的LSD检验。P

2 结果

2.1 40%红细胞悬液G6PD缺乏者GSH及MetHb测定

槲皮素对G6PD缺乏者红细胞具有明显的氧化作用，GSH呈下降趋势，而MetHb则显著上升（P

表1 40%红细胞悬液G6PD缺乏者GSH及MetHb测定（x±s）

注：与低浓度比较，t1=4.925，t2=12.201，t3=4.925，t4=16.660，*P

2.2 α-萘酚与DMSO对GSH及MetHb的影响分析

缺失组与正常组受到的α-萘酚影响存在明显差异，两组孵育体系表现差异显著，见表2。

3 讨论

G6PD缺乏者由于红细胞中还原性谷胱甘肽对氧化性物质有对抗作用，使得血红蛋白、膜脂质受到影响，氧化后变为高铁血红蛋白，促使交联细胞及Heinz形成，使形态结构出现明显变化，最终可能导致红细胞破溶，另可能导致经内皮网状系统清除[3]。D6PD缺乏者红细胞氧化性损害可不断累积，因此必须防止降低红细胞GSH提高氧化性压力的干扰[4]。

红细胞损伤程度受氧化物质损伤的影响受到红细胞压积的影响，当红细胞压积较小时，氧化损伤程度则越高。一般情况下成年男性的红细胞压积值约为40%～50%，因此选择40%红细胞悬液孵育体系对药物影响红细胞氧化作用的考察更为有利[5]。抗氧化物质、脂质、蛋白等物质均处于血浆中，全血中红细胞氧化程度轻微，其检测客观性较高，可准确反映出生理状态[6]。

α-萘酚可能引发患者发生溶血性贫血，使GSH水平降低，另可提高MetHb水平上升。槲皮素氧化作用较强，在中浓度下即导致可造成较大的氧化性损伤，同时其能够使全血中G6PD缺乏者红细胞Hb发生氧化的物质[7]。

有研究显示，包含槲皮素在内的众多黄酮类化合物对正常者红细胞及干细胞均有一定的氧化作用[8，9]，除懈皮素外的黄酮类化合物大多需和过氧化物酶/H202发生反应以参与这一过程，与黄酮类化合物催化氧化机制符合，但同时无法对其非催化氧化作用做出解释[10]。有研究显示[11，12]，懈皮素脂性大，可直接氧化Hb，芦丁具有较高的亲水性，较难透过细胞膜直接氧化Hb，所以不会对G6PD缺乏者、正常者的MetHb和红细胞GSH产生明显影响。

本次研究对不同浓度槲皮素对G6PD缺乏者红细胞的氧化作用进行研究，而其氧化机制还需深入研究，可以确定的是槲皮素会提高缺乏者的氧化性压力，从而产生氧化性损伤。因此G6PD患者应谨慎使用，防止长期使用高浓度的槲皮素，尤其是新生儿、儿童及感染或遗传性溶血性疾病等患者应避免使用。

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（收稿日期：2014-09-23）