抗病毒口服液中连翘苷含量测定方法研究进展

摘要：测定连翘苷含量是控制抗病毒口服液质量的重要组成部分。现将抗病毒口服液中连翘苷含量测定方法的研究进展作一综述，并对不同的测定方法作了比较。

关键词：抗病毒口服液；连翘苷；含量测定；综述

中图分类号：R978.7文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)04-0026-03

Progress on Quantitative Determination of Phillyrin in Antiviral Oral Solution

DENG Li-ming，CHEN Han

(1. Guangdong College of Pharmacy, Guangzhou 510006, China;

2. Jiangsu Institute for Drug Control, Nanjing 210008, China)

Abstract：The quantitative determination of phillyrin is a very important part of the quality control of Antiviral Oral Solution. This article thoroughly reviews the present methods of assaying of phillyrin and the different determination methods are compared.

Key words：Antiviral Oral Solution; phillyrin; quantitative determination; review literature

抗病毒口服液主要用于治疗风热感冒、温病发热、上呼吸道感染、流感、腮腺炎等病毒感染性疾患，近年对其质量标准研究的文献很多，现就抗病毒口服液处方主药连翘中连翘苷的含量测定方法研究进展作一综述。

连翘为木犀科植物Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl的干燥果实，性微寒，味苦，有清热毒、消肿散结之功效[1]。连翘的化学成分为挥发油、连翘苷等木脂素类，齐墩果酸等三萜酸类等[2]，其中连翘苷具有较强的抑菌作用[3]。不同来源的连翘药材中连翘苷含量相差较大，影响制剂的疗效。有关抗病毒口服液中连翘苷含量测定的报道较多，主要有高效液相色谱法（HPLC）和薄层色谱扫描法（TLCS）。中国药典2000年版一部规定，每1 mL抗病毒口服液含连翘以连翘苷计不得少于3μg，而报道文献的实验结果中最低含量为2.97μg/mL，最高含量为30.0μg/mL。

1高效液相色谱法

1.1反相高效液相色谱法

桑旭峰[4]用LUNAC18(2)色谱柱（4.6 mm×150 mm，5μm），流动相为乙腈-水（25∶75），检测波长277 nm，流速0.9 mL/min ，柱温35 ℃，进样量10μL。样品溶液制备的方法是：抗病毒口服液50 mL置入分液漏斗，用乙酸乙酯提取6次，每次30 mL，合并提取液，蒸发至干。残留物溶于5 mL 30 %乙醇，上D101 型大孔树脂柱（1 cm×24 cm），用150 mL 30%乙醇冲洗，弃洗液。再用150 mL 50%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，50%甲醇溶解残留物，置入1 mL量瓶，加甲醇至刻度，用0.45μm微孔滤膜过滤。测定抗病毒口服液中连翘苷含量为2.972～3.065 μg/mL。线性范围为0.46～2.3μg，回归方程为 Y = 986.55X +103.25，回收率为100.1%。

肖伟等[5]用ODS 柱，其它色谱条件同上。样品溶液制备方法：抗病毒口服液25 mL 置100 mL圆底烧瓶中，加入氯仿水浴回流提取20 min×4次，每次用氯仿25 mL；合并提取液，水浴浓缩近干，加氧化铝1 g搅拌均匀，上装有2 g氧化铝的色谱柱，用100 mL 70%乙醇冲洗，收集洗脱液，浓缩至干，加甲醇溶解，定容于2 mL量瓶，摇匀，微孔滤膜过滤。测定抗病毒口服液中连翘苷含量为10.5～12.0μg/mL。经方法学考察，连翘苷在0.05～5μg范围内峰面积X与浓度Y呈良好线性关系。连翘苷回归方程为：Y = 0.001 65X ―0.066 44，r = 0.999 9。平均回收率为100.2%，RSD为3.61%（n= 5）。

黄晓玲等[6]用Agilent Hypersil ODS柱（250.0 mm×4.0 mm，5μm），流动相为乙腈-0.01％磷酸溶液进行梯度洗脱：

流速1 mL/min，检测波长277 nm，进样量10μL。样品溶液制备方法：抗病毒口服液25 mL用醋酸乙酯振摇提取6次，每次25 mL，合并提取液，蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至5 mL，摇匀，微孔滤膜过滤。测定连翘苷含量为22～30μg/mL。经方法学考察，回归方程为Y =5 060.39X－ 6.30，r =0.999 8。线性范围为0.1～0.6μg/μL。连翘苷回收率为99.87%，RSD=1.93%（n=5）。

卢日刚等[7]用Inertsil ODS色谱柱（4. 6 mm×250 mm，10μm）；流动相是乙腈-水（含1 %三乙胺，以冰醋酸调pH 值至7.0）（25∶75）；检测波长277 nm。样品溶液制备的方法：精密吸取本品50 mL，置于分液漏斗，用醋酸乙酯振摇提取6次，每次30 mL，合并提取液，回收醋酸乙酯，蒸干，残渣加5 mL 30 %乙醇使溶解，上D101型大孔吸附树脂柱（1 cm×24 cm），用150 mL 30%乙醇溶液洗脱，弃洗脱液。再用150 mL 50 %乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用少量甲醇溶解，并转移至1 mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过。连翘苷含量为58.0 ～81. 9μg/支。经方法学考察，回归方程为：Y = 1.221×107 X－ 1.87×105，r = 0.999 9。连翘苷进样量在4.24～21.2μg范围内线性关系良好。平均回收率为99.09%，RSD = 0.4%（n = 6）。

张庆伟[8]用Kromasil C18柱（4.6 mm×200 mm，5μm），流动相为乙腈-水（30∶70）；检测波长277 nm，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，进样量20μL。样品溶液制备的方法：抗病毒口服液25 mL置分液漏斗，用乙酸乙酯振摇提取5次，每次20 mL。合并提取液，回收乙酸乙酯并蒸发至干，残留物溶于5 mL 60%乙醇中，置入已处理好的大孔树脂柱（1cm×20 cm），先用100 mL 30%乙醇溶液冲洗，弃去洗液，然后用120 mL 60%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩至干。残留物溶于少量甲醇并移入10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，用0.45μm 滤膜过滤。抗病毒口服液中连翘苷含量为 4.90～5.57μg/mL。经方法学考察，连翘苷的回归方程为：C = 7.126×10- 6 A + 0.207，r = 0.999 9，连翘苷在2.0～16.0μg/mL 范围内呈线性。回收率为98.3%，RSD=1.64%（n＝6）。

王春芳等[9]用Krom asilC18柱（4.6 mm×200 mm，5μm），流动相为乙腈-水（23∶77），检测波长229 nm，样品用氯仿提取。抗病毒口服液中连翘苷含量为13.73～63.25μg/mL。董方法等[10]用ODS（4.6 mm×150 mm）柱，流动相为乙腈-水（25∶75），检测波长280 nm。样品用氯仿回流提取。抗病毒口服液中连翘苷含量10.10～10.22μg/mL。

1.2正相高效液相色谱法

张国刚等[11]用键合氨基柱（4.6 mm×25.0 cm ，10μm），流动相为氯仿-甲醇（6∶1），检测波长277 nm，流速1.0 mL/ min，进样量20μL。样品溶液制备方法：抗病毒口服液20 mL，置入50 mL圆底烧瓶，加氯仿分3次热水浴回流提取，每次用20 mL氯仿，提取20 min；合并提取液水浴蒸干，加甲醇溶解，定容于1 mL量瓶，摇匀，用微孔滤膜过滤。抗病毒口服液中连翘苷含量为14.09～14.45μg/mL。经方法学考察, 连翘苷在0.1～0.5 mg/mL的浓度范围内呈良好线性关系。连翘苷色谱峰面积积分值（A）与连翘苷浓度（C）之间的回归方程为：C = 8.12×10-8A+4.89×10-3，r＝0.999 9。平均回收率为（100.6±2.2）% ，RSD为2.22%（n=5）。

2薄层色谱扫描法

张军平等[12]采用0.3%羧甲基纤维素钠的硅胶GF254薄层板，置紫外灯（254 nm）下定位，展开剂为氯仿-甲醇（9∶1），扫描条件为λR=280 nm，λR=320 nm。样品溶液制备方法：抗病毒口服液50 mL，醋酸乙酯提取6次，每次30 mL，合并提取液，将醋酸乙酯层蒸干，残渣溶于5 mL 30%乙醇溶液中，置入D101型大孔树脂柱（1 cm×25 cm），用30%乙醇溶液150 mL洗脱，弃洗脱液，继而用50%乙醇溶液150 mL洗脱，收集洗脱液蒸干，残渣溶于少量甲醇，移入1 mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，密塞，摇匀。测定连翘苷为3.9～4.2μg/mL。经方法学考察，连翘苷在1.0～5.0μg范围内呈良好线性关系。回归方程：Y = 264.355 X + 9.631，r = 0.999 8。加样回收试验，连翘苷回收率为99.6% ，RSD为2.41%（n＝5）。

3讨论

3.1提取次数的考察

用乙酸乙酯提取制备供试品的方法，原标准及部分文献用乙酸乙酯振摇提取6次，每次30 mL。卢日刚等[12]的实验结果表明，以醋酸乙酯提取5次（每次20 mL）能提取完全。

3.2提取溶剂的选择

肖伟等[5]分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯为提取溶剂制备供试品溶液，最后确定以氯仿水浴回流提取，改进了原制备方法步骤多、时间长、有机溶剂用量大等缺点

3.3样品预处理方法

抗病毒口服液成分复杂，且含有蔗糖、蜂蜜等水溶性物质。在制备样品溶液过程中，原标准及较多文献 [4,7,8,12]都采用大孔吸附树脂柱对样品纯化。 董万法等[10]、肖伟等[5]用中性氧化铝柱代替大孔吸附树脂柱处理样品。肖伟等比较了大孔树脂、氧化铝处理的分离纯化方法，最后确定过中性氧化铝柱分离连翘苷较好。黄晓玲等[6]报道，取消大孔树脂柱的洗脱过程可减少连翘苷的含量损失，缩短操作时间。

3.4流动相的选择

流动相溶剂多用乙腈-水，但浓度比不同。有参照中国药典2000年版一部连翘药材项下的色谱条件，用乙腈-水（25∶75）为流动相的报道[7]。实验表明，此流动相峰形较“胖”，且有拖尾现象，经在水中加入1 %的三乙胺改性，并用冰醋酸调pH值为7.0后，上述现象消失。

3.5检测波长的选择

根据连翘苷的紫外吸收曲线，连翘苷在209，229，277 nm 处均有最大吸收。但209 nm为近紫外吸收，文献普遍选择277 nm波长测定。桑旭峰[4]用二极管阵列检测器紫外扫描对照品中连翘苷色谱峰，分析紫外吸收图谱，发现277 nm处其他成分干扰较少。

3.6测定方法的比较

抗病毒口服液杂质干扰严重，有效成分分离效果差，采用薄层色谱扫描法测定含量时常出现斑点不清、拖尾等现象。高效液相色谱法集分离和测定为一体，简便、稳定、重复性好，易与样品中其它成分分开。故目前测定连翘苷含量多用高效液相色谱法，并且一般采用反相色谱。

参考文献

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[2]刘东雷，李会轻，徐绥绪. 连翘属植物化学成分的研究进展[J]. 沈阳药科大学学报，1995，12（4）：301.

[3]都恒青，王升启，李朝民. 连翘叶的化学成分[J]. 中草药，1986，17（2）：7.

[4]桑旭峰. HPLC法测定抗病毒口服液中连翘苷含量[J]. 药学实践杂志，2004，2（3）：168-170.

[5]肖伟，范庆林，詹永成，等. RP-HPLC测定抗病毒口服液中连翘苷的含量[J]. 江苏药学与临床研究，2003，11（2）：20-22.

[6]黄晓玲，刘乡乡，王世勇，等. 抗病毒口服液的质量标准研究[J]. 中药新药与临床药理，2004，15（3）：181-183.

[7]卢日刚，刘伟林. 抗病毒口服液质量标准研究[J]. 中成药，2004，26（11）：888-891.

[8]张庆伟，王润岭，李惠芬，等. 抗病毒口服液中连翘苷的含量测定[J]. 中草药，2001，32（9）：804-805.

[9]王春芳，张卫兵. HPLC方法测定抗病毒口服液中连翘苷的含量[J]. 中国药品标准，2004，5（3）：44-46.

[10] 董万法，王健，张法忠，等. 抗病毒口服液含量测定方法的改进[J]. 山东医药工业，2000，19（4）：48-49.

[11] 张国刚，徐绥绪. 高效液相色谱法测定抗病毒口服液中连翘苷的含量[J]. 中草药，1998，29（3）：162-163.

[12] 张军平，黄小兰，乐海平. 抗病毒口服液的质量标准研究[J]. 中成药，2004，26（9）：12-14.