抑制麻风树溃疡病病原菌的土壤细菌筛选

摘 要：通过稀释涂布法分离得土壤细菌63株，采用对峙生长法筛选出营养竞争性抑制麻风树溃疡病病原菌的菌株4株，并进行了初步鉴定，抑制菌株均为革兰氏阳性球菌，有英膜，厌氧或兼性厌氧，具有一定的耐盐性。经初步测定，WT2-2-2-a菌株的抑菌率最高，达42.3%。

关键词：麻风树；溃疡病；土壤细菌；抑制作用；营养竞争

中图分类号 S718 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）14-27-02

Screening of Soil Bacteria Inhibiting Canker of Jatropha curcas

Guo Jianwei1 et al.

（1 College of Life Science and Technology，Key Laboratory of Higher Quality and Efficient Cultivation and Security Control of Crops for Yunnan Province，Honghe University，Mengzi 661100，China）

Abstract：63 strains rhizobacteria were isolated soil samples by streak platemethod ，subquencely 4 nutrient competent strains controlling Botrosphaeria fuliginosa （Moug. et Nestl.） Ell. et Ev. were screened by tablet coating method. 4 strains above were G+ coccus.

Key words：Jatropha curcas；Canker；Soil bacteria；Inhibit；Nutrient competent

麻风树（Jatropha curcas L.）别名黑皂树、膏桐、臭油桐、木花生、小桐子等，是大戟科（Euphorbiaceae）麻风树属落叶灌木或小乔木，具有速生、耐旱、耐贫瘠、含油率高的特点，野生条件下病虫害少；其茎、叶、树皮均有充沛的富含毒蛋白的白色乳汁，可提取生物医药和生物农药；种壳、种子均含油，尤其是种子含油率达31.1%～47.2%，可加工生物柴油[1-3]。

据武建榕2008年首次报道，小桐子溃疡病最初发生于嫁接的插穗上，病原菌为褐黑葡萄座腔菌[Botrosphaeria fuliginosa（Moug. et Nestl.）Ell.et Ev.]和Pseudoseptoria sp1。其症状表现为：初期插穗的地上部分枯死，后期干燥条件下出现许多半埋生于表皮层的黑褐色小点，最终生根的插条枯死[4]。据吕相贤、何家柏、郭建伟调查，云南省双柏县、建水县、蒙自县、元阳县的小桐子种植林均发生了严重的茎溃疡病，经病原菌分离、鉴定为褐黑葡萄座腔菌。目前，上述地区的小桐子属于粗放式管理，每3a施药施肥一次，农药以多菌灵、代森锰锌为主，防治效果不佳；此外，利用生物防治该病害的研究还鲜见报道。

植物土壤细菌是指存在于植物根际土壤中的一类与植物互利共生的细菌，对植物无可见危害。1978年Burr和Schroth首先报道马铃薯根际土壤细菌，随后国内外研究已经证实多种根际土壤细菌的广泛存在，目前报导最多的根际土壤细菌菌株有假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、农杆菌属（Agrobacterium）、埃文氏菌属（Eriwinia）、黄杆菌属（Flavobacterium）、巴斯德氏菌属（Pasteuria）等[5]。王丽珍等从烟草根际土壤中分离出对烟草青枯病菌有拮抗活性的菌株348株，经复筛还发现：其中29株菌对赤星菌的抑菌带宽达8.0～12.0mm，26株菌对黑胫菌的抑菌带宽达9.0～14.0mm，31株菌对青枯菌的抑菌圈直径达30.0～42.0mm[6]。因而，从小桐子能源林土壤分离溃疡病拮抗性细菌，具有一定的可行性和潜在的应用价值。

1 材料与方法

1.1 土样 小桐子根际土壤样品由何家柏和吕相贤于2011年10月采集自蒙自市草坝镇碧色寨麻疯树能源林；分别从沟底（土壤较湿润、肥沃，腐殖质多）、坡上（土壤干燥、贫瘠，以砂石为主）的林中5点取样，共10份土样。

1.2 病原菌活化 将分离自上述地点的褐黑葡萄座腔菌转接在新鲜PDA培养基上，活化、备用。

1.3 培养基 PDA培养基：葡萄糖20g、马铃薯200g、琼脂20g、蒸馏水1 000mL，pH自然（对峙培养筛选拮抗性细菌时加20g蛋白胨）；NA培养基：牛肉膏3g、NaCl5g，蛋白胨10g、琼脂20g、蒸馏水1 000mL，pH7.0～7.2 [7]。

以上相应的固体或液体培养基以加琼脂与否为标准。

1.4 土壤细菌的分离、纯化 常规平板稀释培养法分离土壤细菌并经划线法纯化[7]。

1.5 拮抗细菌的筛选与相对抑制率测定 采用3点接种法将细菌与病原菌接种在加有蛋白胨的PDA培养基上，28℃恒温培养5～14d，观察是否抑制病原菌；如抑制，则计算相对抑菌率[8]。

相对抑菌率（%）=（病原菌菌落半径-病原菌接种点到凹痕的距离）/菌落半径×100。

1.6 抑制菌株的形态及部分生理生化测定 对抑制病原菌的细菌菌株进行革兰氏染色、荚膜染色、运动性测试、接触酶反应等基本的形态学与生理生化测定[7]。

2 结果与分析

2.1 土壤细菌的分离 从10份土壤样品中分离出具有不同菌落特征的细菌63株，说明麻风树根际土壤具有较为丰富的细菌资源。

2.2 抑制病原菌的土壤细菌的筛选与相对抑菌率 采用对峙生长法筛选出4株覆盖病原菌菌丝并阻止其进一步生长的细菌，其菌落特征及抑菌作用见表1和图1。

表1 对小桐子溃疡病病原菌具有抑制作用的4个菌株特征

[筛选菌株＼&菌落色泽＼&菌落特征＼&相对抑菌率（%）＼&WT4-1＼&乳白色＼&较湿润、光滑、透明＼&21.4＼&WT2-1-2＼&乳黄色＼&干燥、边沿整齐、不透明＼&16.7＼&WT2-2-2-a＼&淡乳黄色＼&湿润、光滑、透明＼&42.3＼&WT2-2-2-b＼&淡乳黄色＼&湿润、光滑、不透明＼&38.6＼&]

注：A.WT2-2-2-a菌株对溃疡病病原菌抑制作用；B.WT2-1-2菌株对溃疡病病原菌的抑制作用；C.病原菌

图1 筛选菌株对溃疡病病原菌的抑制作用

2.3 抑制病原菌的土壤细菌的初步鉴定 如表2所示，4株细菌均为革兰氏阳性球菌，有荚膜，厌氧或兼性厌氧，都可以在含5%NaCl的培养基上生长，具有一定的耐盐性。其中，WT4-1接触酶反应阴性，在7%NaCl的培养基上不能生长，其余菌株接触酶反应均为阳性，耐7%NaCl但不耐10%NaCl；WT2-1-2不具备运动性，其余菌株沿穿刺线云雾状生长，均具有运动性。

表2 拮抗菌株生理生化鉴定

[菌株＼&革兰氏染色＼&荚膜染色＼&运动性＼&厌氧性测定＼&耐盐性试验＼&接触酶反应

（3% H2O2）＼&2%NaCl＼&5%NaCl＼&7%NaCl＼&10%NaCl＼&WT4-1＼&+，球菌＼&+＼&+＼&厌氧＼&+＼&+＼&-＼&-＼&-＼&WT2-1-2＼&+，球菌＼&+＼&-＼&兼性厌氧＼&+＼&+＼&+＼&-＼&+＼&WT2-2-2-a＼&+，球菌＼&+＼&+＼&兼性厌氧＼&+＼&+＼&+＼&-＼&+＼&WT2-2-2-b＼&+，球菌＼&+＼&+＼&兼性厌氧＼&+＼&+＼&+＼&-＼&+＼&]

3 小结与讨论

3.1 土壤细菌的分离、纯化 本试验采用稀释涂布平板法从小桐子能源林土壤样品中共分离到63株形态各异的土壤细菌，说明小桐子根部土壤细菌具有丰富的多样性，与前人关于植物根际细菌普遍存在的观点是相符的。

3.2 抑制病原菌细菌的筛选 据报道，根际土壤微生物可通过侵染位点的隔离与重寄生、营养竞争、拮抗作用等抑制植物病原菌[5，6，8-10]。本试验通过对峙生长法发现：4株细菌虽然不产生抑菌圈但会覆盖褐黑葡萄座腔菌菌丝并抑制其生长，4菌株可能通过营养竞争作用抑制病原菌。

前人对土壤细菌的研究多数是对有关草本作物而非乔本植物，虽然不能简单类比，但显然本研究分离到的抑制病原菌菌株的概率偏低。褐黑葡萄座腔菌在麻风树茎干上导致溃疡病，尚无土传的研究报道，本研究以其为靶标从土壤筛选抑制性菌株，但土壤中抑制该菌的细菌与其他微生物相比缺乏生存优势而难以筛选出来，可能是本研究分离抑制性菌株偏小的原因。

致谢：特别感谢红河学院2008级吕相贤提供病害调查数据，感谢李河、全舒舟老师在试剂采购中给予帮助。

参考文献

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[6]王丽珍，肖崇刚.重庆烟草主要病害土壤拮抗细菌的筛选[J].烟草科技，2008（4）：60-64. （下转58页）

（上接28页）[7]周德庆.微生物实验手册[M ].上海：上海科技出版社，1986：97-115.

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[10]Ahmad F，Ahmad I，Khan MS. Screening of free-livingrhizospheric bacteria for their multiple plant growthpromoting activities[J]. Microbiological Research，2008，163（2）：173-181.