牙菌斑生物膜的细菌生长抑制因子

[摘要]牙菌斑生物膜中的细菌是龋病发生的先决条件，而口腔内存在多种细菌生长的抑制因子，它们对细菌的生长或菌斑的形成起一定抑制作用。细菌生长的抑制因子主要来自宿主和细菌本身产生的细菌素以及其他代谢产物，本文就致龋菌生长抑制因子的种类及作用的研究进展作一综述。

[关键词]龋病；牙菌斑；抑制因子；细菌素

[中图分类号]R 781[文献标志码]A[doi]10.3969/j.issn.1673-5749.2012.02.016

Growth inhibition factors for the bacteria consist of dental plaque biofilmWu Guitang, Zhou Lili, Liu Xingrong.（Dept. of Oral Medicine, The Affiliated Hospital of Stomatology of Luzhou Medical School, Luzhou 646000, China）

[Abstract]The existence of bacteria in dental plaque is the precondition for dental caries to occur. Many inhibition factors（IF）lie in oral cavity restrain bacteria to grow and form dental plaque. These inhibition factors usually come from host and bacteriocin which generated by kinds of cariogenic bacteria, and also from kinds of metabo－lized product. This review mainly introduced research progress on the species and function of IF in growth of caries-related bacteria.

[Key words]dental caries；dental plaque；inhibition factors；bacteriocin

牙菌斑生物膜中有200~400种细菌，但其中仅1%~10%可以培养，以厌氧菌居多，主要致龋菌为变异链球菌（Streptococcus mutans，S.mutans），其次是乳杆菌和黏性放线菌。细菌的致龋性基于其对牙齿表面强大的附着能力，利用蔗糖产酸以及耐酸能力；而来自宿主口腔内的某些成分有起到抑制细菌生长，并且细菌产生的细菌素通过抑制蛋白质合成，影响DNA代谢和能量代谢等来杀伤细菌细胞，在牙菌斑生态中起一定的调节作用。本文就细菌生长的抑制因子作一综述。

1来自宿主的成分

1.1溶菌酶

溶菌酶是一种相对分子质量低，不耐热的由多个基因控制的碱性蛋白。口腔内的溶菌酶主要来自大唾液腺、唇部小唾液腺、龈沟液及游走进入口腔的白细胞。溶菌酶作用于革兰阳性细菌胞壁氨基多糖N-乙酰胞壁酸与N-乙酰葡糖胺之间β-1,4糖苷键、肽链断裂，细胞内容物逸出而产生溶菌作用。溶菌酶以2种形式存在于唾液：1）游离型；2）与阴离子蛋白和多糖构成可逆的复合物型。具有抗体非依赖性防御功能，其抗菌活性是聚集细菌，导致菌细胞解链，妨碍胞内代谢，改变细胞通透性，以致抑菌、溶菌、杀菌。Li等[1]用抗体检测出牙齿釉质表面覆盖的薄膜中含有溶菌酶的多种蛋白质，该薄膜在釉质和口腔环境之间提供保护性的界面。研究显示，溶菌酶等小分子物质处于口腔疾病防御的第一防线，可以影响口腔中的生态环境，继而影响唾液中的链球菌种类和牙齿表面菌斑的组成成分。唾液溶菌酶水平与牙菌斑的形成和龋齿的发生有密切关系，溶菌酶水平越低，牙菌斑和龋齿越容易发生[2]。

1.2特异性抗体

唾液中最重要的特异性抗体是分泌型免疫球蛋白（secretory immunoglobulin A，SIgA），在唾液总抗体中的质量分数占45%，来源于机体的黏膜共同免疫系统，由腺体内浆细胞和黏性腺上皮合成。SIgA根据其重链的不同将其分为2种亚类，即SIgA1和SIgA2。在分泌液中占总量的50%~ 74%。SIgA1在唾液和菌斑内易被血链球菌、缓症链球菌等细菌产生的蛋白水解酶降解；而SIgA2因为分泌片的保护，能够抵挡蛋白水解酶的消化作用，维护SIgA结构的完整性。SIgA可以结合细菌的表面结构或表面抗原，阻止、干预细菌对牙面或黏膜的附着，通过凝集作用使细菌聚集成丛而被清除。S.mutans对唾液包被的羟磷灰石的黏附会被人体自然产生的SIgA所抑制。Jia等[3]在动物模型免疫防龋的研究中发现，被动免疫和主动免疫可以诱导、促进唾液和血清特异性IgA抗体的产生。在口腔环境中，IgA主要的生物学作用：1）通过凝结作用抑制细菌在口腔内定居；2）结合细菌的特殊抗原干扰细菌黏附；3）影响细菌代谢的特殊活性。

1.3黏蛋白

黏蛋白是一种结合有糖链的特异蛋白，是黏液腺的主要有机成分，由下颌下腺、舌下腺和大量的小唾液腺所分泌。人类唾液黏蛋白主要有2种类型：高相对分子质量唾液黏蛋白（high-molecular-weight mucin，MG1）和低相对分子质量唾液黏蛋白（low-molecular-weight mucin，MG2），并且能被细菌识别而与之结合，导致细菌的凝集使之失去附着至软、硬组织的能力，进而通过唾液流动的冲刷和吞咽被迅速排出口腔。虽然二者在理化性质上有很多共同点，但其结构和功能上却存在明显的差异。MG1亚硫酸盐较多，对羟磷灰石亲和力大，是牙齿初期获得性膜的组成成分，对牙齿起一定的保护作用，并可借助其疏水键覆盖于黏膜表面，维护黏膜湿润，减少咀嚼时的摩擦力，阻止致病菌、潜在微生物以及酸和蛋白水解酶的侵入，保护口腔软组织。徐燕等[4]就人类唾液黏蛋白对口腔S.mutans凝集影响的实验研究表明：MG1对3种链球菌均具有一定的凝集作用，但作用低于腮腺外唾液（extraparotid saliva，EPS），因ESP中还含有MG2。同时，MG1与链球菌的凝结作用与其浓度相关，从颌下/舌下腺唾液纯化的MG1能有效地抑制有机酸对牙面釉质的脱矿作用，起到保护牙齿的作用。MG2对牙面的亲和力不高，但其独特的功能在于其内含大量的神经氨酸，能与一些细菌发生特异性作用，还能与血链球菌和轻链菌结合，促进细菌凝集成团，有利于细菌从口腔中清除，调节口腔菌丛，防止龋病和牙周病的发生和发展。

1.4过氧化物酶系

过氧化物酶是一种血红蛋白酶，与唾液中的硫氰酸盐组成抗菌系统，主要作用于一些需氧菌和碱性厌氧菌。酶氧化的产物亚硫酸氰酸能氧化细胞壁和胞内的硫醇基，使细菌延迟生长和代谢，唾液中存在的过氧化物酶系统对龋病的发生起一定的抑制作用。亚硫酸氰酸是一种有毒物质，能够有效地干扰细菌代谢并终止糖酵解过程，是控制口腔菌群非常重要的物质。

1.5乳铁蛋白

乳铁蛋白（1actoferrin，LF）是一种和铁结合的糖蛋白，其抗菌功能主要与其分子结构特性有关。结合Fe3+，限制细菌生长被认为是LF的一种重要抗菌机制。铁是大多数细菌生长所必需的金属离子，LF通过螯合Fe3+限制细菌对Fe3+的利用，抑制链球菌等生长[5]。LF能够抑制细菌生物膜的形成。Weinberg[6]认为在细菌生物膜形成的初始黏附、发展和成熟阶段，均需Fe3+介导。LF分子有多种抗菌机制，如与负电性的生物大分子结合或是发挥蛋白水解酶活性降解细菌黏附蛋白等。LF对革兰阳性菌的杀菌机制与两亲性抗菌肽作用机制相似，即阳离子性氨基酸残基与膜上带负电荷的磷壁酸通过静电相互作用结合两亲性的氨基酸残基打破了细菌内膜的非极性环境，造成膜通透性发生改变，使菌体内容物外泄而致死[7-8]。当然，LF在通过与铁结合，抑制细菌生物膜形成，破坏细胞膜稳定性，降解细菌毒力蛋白，防止致病菌入侵等多种方式发挥其抗菌作用的同时，也在很大程度上受制于体外实验条件，如环境pH、温度、LF饱和度、缓冲液等。

2来自细菌的细菌素

细菌素是由具有染色体外基因的细菌合成的一种杀菌性蛋白质，通过抑制蛋白质的合成，影响DNA代谢和能量代谢等发挥杀伤菌细胞的作用。牙菌斑中既有产生细菌素的细菌，也有对细菌素敏感的细菌，因此细菌素在调节牙菌斑生态中起一定作用。来自细菌的细菌素主要有变链素、血链素和乳杆菌素。

2.1变链素

由S.mutans产生的细菌素叫变链素。目前已有多种变链素被分离和纯化，并完成氨基酸序列和基因序列的分析。S.mutans是龋病的主要致龋菌，对其变链素的研究可为进一步了解S.mutans与口腔微生态的关系，龋病的生态防治等提供理论依据。S.mutans至少可以产生5种细菌素：变链素Ⅰ~Ⅴ。变链素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ属于含羊毛硫氨酸的乳链菌肽，抗菌谱相对较宽，变链素Ⅳ、Ⅴ则是未修饰的非乳链菌肽。Qi等[9]发现Ⅰ型变异链球菌株UA140能产生2种细菌素：一种属于羊毛硫细菌素，即变链素Ⅰ；另一种却属于非羊毛硫细菌素，即变链素Ⅳ。变链素Ⅳ对缓症链球菌家族成员的作用特别活跃。李颂等[10]对变链素粗提物活性的研究发现，10 mL液体的粗提物可形成直径19 mm的抑菌环，这表明粗提物具有抗菌活性。将粗提物加热到80℃，抗菌活性则可维持120 min，表明其中含有热稳定性抗菌物质。变链素的作用与S.mutans在口腔生物膜中的普遍存在及成功定植相关。一些细菌素也可抑制血链球菌的生长，这可能是在S.mutans水平较高的菌斑中血链球菌水平较低的原因之一。一些生物膜成员的细菌素表达可能决定了其共生菌的种类，随着对类似变链素这类抗生素的进一步研究，利用其抗菌活性高、抗菌谱广、靶菌株不易产生抗性突变等优点为新一代抗龋疫苗提供了广阔前景[11]。

2.2血链素

在牙菌斑的早期定居菌中，S.mutans并不占主导地位，因其与获得性膜的直接结合能力远逊色于早期定居菌之一的血链球菌。血链球菌对于其他细菌在口腔的黏附、定植具有重要的生物学作用。S.mutans与血链球菌为了竞争牙面生态位点存在着相互拮抗的关系，而这种拮抗关系与其细菌素及细菌素样物质有关。寇育荣等[12]对血链球菌产生的血链素的分离纯化、抑菌活性、抑菌机制等方面都进行了深入的研究，且研究主要集中在与牙周病的关系及防治方面，认为血链球菌产生的细菌素对牙周可疑致病菌具有较强的拮抗作用，而血链素在龋病发生发展及防治中的作用认识有限。研究[13]发现，血链球菌10556产生的新的抗菌蛋白可能用于预防和治疗龋病。

2.3乳杆菌素

乳杆菌是口腔的正常菌群，可定植在口腔的各个部位，尽管其数量只占口腔细菌的1%，但却与龋病的发生有着重要的联系，特别是根面龋和牙本质龋。乳杆菌产生的细菌素统称乳杆菌素。现在已发现了多种乳杆菌的细菌素，但它们的作用方式、相对分子质量及生化特性不尽相同，抑菌范围也不一样。有研究报道的由戊糖乳杆菌产生的细菌素有广泛的抑菌谱，尤其对李斯特菌有较强的抑制作用；而有些乳杆菌所产生的细菌素其抑菌范围较窄，只对亲缘关系较近的乳杆菌有抑制作用。Smith等[14]对93例患龋者的菌斑和唾液进行研究，共得到104株分离株，其中乳杆菌65株占62.5%。他们测试了分离得到的所有乳杆菌产生的细菌素对大肠杆菌属、沙门菌属、志贺菌属、克雷伯菌属及弯曲杆菌属细菌的作用，发现除丙酸杆菌外其他乳酸菌产生的细菌素至少能抑制1种指示菌，其中嗜酸乳杆菌与龋病关系最为密切。Chumchalová等[15]对嗜酸乳杆菌CH5产生的细菌素acidocin5进行鉴定和提纯，证明了该细菌素有较宽的抗菌谱。Deraz等[16]研究嗜酸乳杆菌DSM20079产生的细菌素acidocin 20079的物理化学性质，测定了该细菌素的部分肽段序列和二级结构，并证实acidocin 20079的活性伴有细胞溶解的杀菌作用。

2.4其他细菌素

近年来众多学者对口腔内的细菌尤其是与龋病相关的细菌素进行了大量研究。如研究发现，含乳链菌素3147的食物能有效抑制口腔内的变异链球菌。唾液链球菌K12产生的细菌素可被用作口腔抗微生物的靶标[17]。Horz等[18]评估唾液链球菌K12的分布和保留时间，结果发现唾液链球菌K12有控制口腔感染的潜力。口腔卟啉单胞菌和产黑色素的普雷沃菌产生的黑色素菌素可抑制口腔中不产黑色素的革兰阴性无牙胞厌氧杆菌如口腔普雷沃菌、梭杆菌等，还可以抑制口腔链球菌如唾液链球菌的生长。

3细菌的代谢产物

牙菌斑生物膜的物质代谢包括糖类、蛋白质、脂肪、氨基酸和尿素等，其中与龋病关系密切的是糖类和碱性物质的代谢。细菌代谢产生的有机酸主要有乳酸、甲酸、乙酸和丙酸等。这些产酸菌在降低环境pH的同时也抑制了非耐酸菌的生长，韦荣菌利用其他菌产生的乳酸作为能源使菌斑pH上升。血链球菌产生的H2O2能抑制乳杆菌和放线菌的生长。同时菌斑内碱性物质的代谢主要是尿素的水解。菌斑中的氨基酸可以被细菌利用，在氨基酸发生脱羧作用时会产生胺和CO2，使pH上升。牙菌斑生物膜内反复进行酸碱物质的代谢活动，对菌斑pH起重要作用，也与牙菌斑的致龋性密切相关。

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