6株溶磷菌和4株固氮菌混合培养条件的研究

摘要： 对6株溶磷菌和4株固氮菌混合培养，选择最适培养条件即温度，pH和盐分，为确定促生菌的最佳发酵条件和生态适应性评价提供依据。结果表明：溶磷菌和固氮菌单独培养或混合培养最适温度在25～35 ℃，混合培养较单独培养生长良好；溶磷菌和固氮菌单独培养或混合培养最适pH为6.5～7.5，在pH 7.5～8.5偏碱性环境下，混合培养生长较好，较单独培养耐碱性更强；菌株Lx81+W5组合，Lx191+W5组合和Jm92+W5组合可以在7%的盐浓度下正常生长，较单独培养表现出更强的耐盐性。

关键词： 溶磷菌；固氮菌；混合培养；温度；pH；盐分

中图分类号： S 144 文献标识码： A

文章编号： 10095500(2011)06000107

早在20世纪1925年就有学者发现不同菌株组合混合培养可以形成不同的产物。研究认为混合培养能减少或避免纯培养过程中生物活性下降的现象，增加培养菌生物量[1]，可以获得更多的菌株性质。陶光灿等[2]研究了细菌组合的固氮，解磷与不同培养条件以及混合培养的研究表明，微生物之间存在着协同作用，这是一个潜能巨大的新的微生物资源，正在逐渐成为新的研究热点。常慧萍等[3]对小麦根际的解磷菌、解钾菌和固氮菌进行了互作研究发现：当两菌株混合后，解磷菌P1616可以促进固氮菌N2106L生长，提高了混合菌悬液中的细胞密度，解磷菌P1616还可以促进解钾菌KL0405的生长。

温度，pH和盐分浓度对菌体生长影响很大，在微生物发酵的过程中要严格控制温度，pH和盐分浓度才能有最大的有效活菌数[4]。溶磷菌和固氮菌混合对温度、pH和盐分浓度等环境因素的响应不同，本研究旨在确定混合菌株对环境因子的适应范围，为后续溶磷菌和固氮菌混合菌剂研制提供理论依据。

基金项目： 国家自然基金“苜蓿根际溶磷菌与根瘤菌互作及促生机理研究”（30960265）资助

作者简介： 刘青海（1985），男，内蒙古包头人，在读硕士。

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姚拓为通讯作者。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

供试菌株为甘肃农业大学草地微生物多样性实验室提供的6株溶磷菌，4株固氮菌(表1)（3株联合固氮菌和1株根瘤菌）。

根瘤菌S11待鉴定苜蓿

1.2 菌株间拮抗反应

分别将活化后的菌株两两相交划线接种在LB平板培养基上，28 ℃培养2～3 d，每天观察交叉点处细菌生长状况，若交叉点两细菌生长弱或不生长，说明两菌株间有拮抗作用，不适合混在一起做复合菌肥；若交叉点细菌生长良好，则说明两菌株可以共存，之间没有抑制作用，不发生拮抗反应的各菌株可以混合培养，可以做复合菌肥。

1.3 菌液的制备

将各供试菌株划线接种于LB固体斜面上，28 ℃下培养24 h，加灭菌水制成菌悬液，用UV721紫外分光度计在D660nm下测定菌悬液浓度，并用无菌水调节D值一致后，备用。

1.4 菌株处理组合

A组 6株溶磷菌单独培养（共计6个处理）；B组 6株溶磷菌和4株固氮菌两两组合（共计24个处理）。

1.5 温度条件对菌株生长的影响

(1)将LB液体培养基分装至试管中，每管5 mL，121 ℃灭菌30 min，备用。

(2)将菌株按0.1 mL接种量接种到液体试管培养基，组合菌每个菌接种0.05 mL，每个菌种组合接种3管，分别标上10、15、20、25、30、35、40、45 ℃标记。

(3)按标记，将各试管置于相应温度的振荡培养箱中培养48 h。

(4)取出观察各菌株的生长情况，测定每个菌株的D660 nm吸光值，并计算平均值，以确定各菌株的最适生长温度。

1.6 初始pH对菌株生长的影响

(1)配置LB液体培养基，分装为11份，分别采用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl依次调节pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，再将LB液体培养基分装至试管中，每管5 mL，分别标上pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0标记，121 ℃灭菌30 min，备用。

(2)将菌株菌悬液按0.1 mL（单菌株）接种量接种到液体试管培养基，组合菌每个菌接种菌悬液0.05 mL（菌株组合），每个组合接种3管。

(3)将标记好的菌株置于28 ℃振荡培养箱中培养48 h，转速为180 r/min。

(4)取出观察各菌株的生长情况，并测定其D660 nm的平均吸光值，确定菌株及组合的最适生长pH。

1.7 盐分对菌株生长影响

在LB培养基中加入NaCl配成1%、3%、5%、7%、9% 5个浓度梯度，灭菌后制成平板备用。将配好的各处理菌悬液以划线法接种于各盐浓度的LB固体培养基上，每个处理3个重复，以不接种的为对照，置28 ℃下培养7 d，观察菌体生长情况。

2 结果与分析

2.1 拮抗测定

拮抗试验是鉴定菌株间菌株菌能否共存的传统方法，6株溶磷菌和4株固氮菌之间均无拮抗反应发生，各菌种可以混合培养。

2.2 温度对菌体生长的影响

由图1～6可以看出，温度对单菌株和混合菌的影响较大，各供试菌株在10～45 ℃均能生长，但差异较显著；各菌株或菌株组合从10～45 ℃的 D660 nm值先增加，到25 ℃或30 ℃时到达峰值，随后开始下降，25～35 ℃是最佳培养温度。

在图1溶磷菌Jm170和根瘤菌S11组合接种在各温度D660 nm值低于单菌株Jm170和Jm170与其他固氮菌组合。在图2～6中，Jx59+G组合在10～45 ℃范围内D660 nm值均高Jx59与其他固氮菌和根瘤菌的组合，当30 ℃时到达峰值，为1.125；溶磷菌Lx81、Lx191、Jm92、Lx22与固氮菌和根瘤菌的组合的D660 nm值在25～45 ℃均显著高于Lx81单独接菌时的D660 nm值；在图5，6中，Jm92+W5和Lx22+G是较优菌株组合，在10～45 ℃D660 nm值均高于其他组合，在10 ℃或45 ℃的条件下均能正常生活，Jm92+W5在10 ℃和45 ℃条件下的D660 nm值分别为0.268和0.278，Lx22+G在10℃和45℃条件下的D660 nm值分别为0.315和0.307，菌体数量较多，可以适应高温或低温的不良环境。

2.3 初始pH对菌体生长的影响

从图7～12可看出，pH对单一菌株和混合菌的生长影响较大，无论单一菌株或混合菌在pH9的培养液中生长缓慢或不生长，pH在6.0～8.0，大部分菌或菌株组合都可以良好生长，当pH为8.5时，Lx191+G和Lx191+S11生长最好，D660 nm值分别为0.475、0.429。可以适应较为碱性的土壤。