电针对MCAO大鼠脑内GAP-43和突触囊泡蛋白表达的影响

［摘要］方法：将实验大鼠分为假手术组、缺血再灌组和缺血再灌＋电针组，大脑中动脉线栓(MCAO)造成局灶性缺血90min，电针组在缺血后立即给予电针1 h，以后每天1次。在缺血再灌1，7和14天分别处死，进行免疫组织化学染色。结果：GAP-43和突触囊泡蛋白主要在缺血灶周围的皮质表达。在再灌后7和14天后电针组GAP-43和突触囊泡蛋白免疫阳性细胞数高于缺血再灌组(P＜0.05)。结论：电针能够提高GAP-43和突触囊泡蛋白在缺血灶周围皮质的表达，从而促进缺血后轴突的出芽和突触的形成，提高了缺血后神经元可塑性。

［主题词］电针；生长结合蛋白-43*；突触膜糖蛋白/代谢；再灌注损伤/针灸疗法Effect of Electroacupuncture on GAP-43 and Synaptophysin Expression of Ischemic Brain in the MCAO Rat

Chen Yinghui, Huang Xianfen (Department of Neurobiology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China)

［Abstract］Purpose To observe the effect of electroacupuncture (EA) on growth-associated protein (GAP-43) and Synaptophysin expression of ischemic brain in the rat by immunohistochemical method. Methods The experiment was divided into three groups: sham operation group, ischemia group and ischemia plus EA group. The middle cerebral artery (MCA) was occluded for 90 min to result in the local ischemia. EA was applied for one hour immediately after cerebral ischemia. Then EA was applied every day till the rats were decapitated after reperfusion for 1,7 and 14 days, respectively. Immunohistochemical method was used. Results GAP-43 and Synaptophysin immunoreactive cells expressed mainly in the surrounding cortex of infarction. In the EA group GAP-43 and Synaptophysin immunoreactive cells after reperfusion for 7 and 14 days were significantly higher than those in the ischemia group (P＜0.05).Conclusion EA may increase expression of GAP-43 and Synaptophysin in the surrounding cortex of infarction, so EA can promote the neuronal sprouting and synaptogenesis after ischemia, and improve the neuronal plasticity.

［Key words］Electroacupuncture; Growth-Associated Protein*; Synaptophysin/metab; Reperfusion Injury/acup ther

脑缺血将导致梗死区的大量神经元死亡，从而使得一定区域内失去神经支配。但这也刺激了未损伤神经元的出芽和建立新的突触联系。这种出芽和突触再生支持了缺血损伤后神经元修复和可塑性的假说。与出芽和突触囊泡有关的蛋白的增加将伴随轴突和树突的出芽以及突触数量的改变。轴突出芽作为解剖可塑性的组成部分能够通过生长结合蛋白-43 (growth-associated protein,GAP-43)的高表达来鉴定。GAP-43是一种膜结合蛋白，它被发现在中枢神经系统的轴突生长锥上。而突触囊泡蛋白(Synaptophysin)作为另一种鉴定轴突出芽和突触再生的蛋白被发现在所有的神经末梢。针灸对脑缺血的疗效尤其是作为促进功能恢复的一种物理疗法已被国际公认。众所周知，功能的恢复应该与神经解剖的可塑性紧密相关。我们以前的实验提示电针能增加缺血周边区神经营养因子的合成或释放，而后者可以促进出芽和突触再生。因此我们以GAP-43和Synaptophysin免疫阳性细胞的数量作为指标，观察较长时间内多次电针的累加效应是否能促进缺血梗死灶周围神经纤维的出芽和突触再生。

1材料和方法

1.1实验动物及分组

Wister雄性大鼠 (230～260 g)，由上海医科大学动物房提供。随机分成3组：假手术组、缺血再灌组和缺血再灌+电针组(以下称电针组)。每组又根据不同的缺血后再灌时间分成3个时间点，每时间点6只大鼠。

1.2动物模型及电针参数

采用大脑中动脉线栓法，将一末端圆钝的4-0尼龙丝线依次通过颈外、颈内动脉插至大脑前交通动脉，阻塞一侧大脑中动脉，造成大脑局部缺血90min，缺血后立即给予电针，取穴为“水沟”和“百会”，时间为1h，强度3.5mA，频率100 Hz。再灌1天后每天给予电针1次，每次1h。3组大鼠分别在缺血再灌后1，7和14天处死。

1.3样品采集及处理

10%水合氯醛腹腔麻醉，心脏快速灌流生理盐水100ml，然后用4%多聚甲醛(4℃)灌流固定30 min。断头取脑放入20%蔗糖多聚甲醛溶液进行后固定，然后置于30%蔗糖脱水。待脑组织下沉后取出作冰冻切片，片厚30μm，取缺血中心的脑片(前囟嘴侧0.2～0.8mm)进行免疫组织化学染色。

1.4免疫组织化学(ABC法)

切片入0.01mol/L磷酸盐缓冲液 (PBS，pH7.2～7.4) 漂洗3次，每次5 min。然后入含有10%正常羊血清和0.2% Triton X-100 PBS 液中，37℃孵育1h。将切片放入稀释后的第1抗体(GAP-43：小鼠抗大鼠单克隆抗体1∶800 Sigma产品；Snaptophysin：小鼠抗大鼠单克隆抗体1∶20DAKO产品) 中，37℃孵育2h，移入4 ℃冰箱孵育48～72h。然后经PBS漂洗3次，切片入生物素标记的第2抗体(Biotin马抗小鼠IgG 1∶200 Vector产品)，37 ℃孵育1h，PBS漂洗3次，入AB peroxidase complex液，37℃孵育1 h，PBS漂洗3次，再用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液洗5min。切片挑入0.05%DAB+0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液，加3%过氧化氢1～2滴显色，显微镜下观察监控呈色反应。切片入0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液终止反应，洗去非特异性着色，贴片，晾干，透明，封片，镜下观察。

对照实验：以正常马血清和PBS代替第1抗体，同步进行上述免疫组织化学染色，结果为阴性。

1.5细胞计数

光镜下(100×)对假手术组一侧前脑半球以及缺血再灌组及电针组缺血侧纹状体和皮层的免疫阳性细胞进行细胞计数。每只大鼠取3张相同缺血部位脑片，每一脑片在皮层随机取10个视野，求其算术平均值。

1.6统计

测定结果均以平均值±标准差表示，进行组间的ANOVA分析。

2实验结果

GAP-43免疫阳性细胞主要分布在双侧大脑半球的皮质和下丘脑，在大脑皮质Ⅲ和Ⅴ层尤其明显。视皮质和运动皮质阳性细胞数多于前侧和颞侧。在皮质的Ⅱ层，GAP-43阳性细胞为小的锥体和非锥体细胞，在Ⅲ层为中等大小的锥体细胞和一些小的非锥体细胞。而在V层混合着大小不等的神经元，其中包括一些运动皮质的大锥体细胞，但在胶质细胞未见其表达，脑缺血后，梗死灶周围皮质和纹状体的GAP-43免疫阳性细胞数量逐渐增加，再灌后1天假手术组、缺血再灌组和电针组的GAP-43免疫阳性细胞数无统计差异(P＞0.05)。而在再灌后7天和14天，电针组的GAP-43免疫阳性细胞数目多于缺血再灌组和假手术组(P＜0.05，见表1、图1、图2)。图1显示光镜下缺血再灌注7天时皮质GAP-43免疫阳性细胞的表达，见深棕色的GAP-43免疫反应物不仅分布在胞体而且扩展到临近的树突和长的轴突上，在胞体GAP-43免疫反应物分布在细胞膜，胞浆和胞核未见染色呈透明状。图2显示再灌7天，电针组皮质GAP-43免疫阳性细胞数显著增多

Synaptophysin免疫阳性细胞分布于两侧大脑皮质的Ⅲ～Ⅴ层、纹状体顶部靠近皮质的部位以及下丘脑和海马结构等灰质结构内，胼胝体未见其表达。缺血后在靠近缺血皮质和纹状体的某些局限区域内(对应于前肢和后肢的皮质区域以及顶叶的1区2区)反应产物密集且染色较深，脑缺血后，梗死灶周围皮质和纹状体的Synaptophysin免疫阳性细胞数量逐渐增加，缺血再灌7天达到高峰，此后逐渐下降。再灌后1天和7天电针组Synaptophysin的免疫阳性细胞数与缺血再灌组相比无统计差异 (P＞0.05)。而在再灌14天，缺血再灌组的Synaptophysin免疫阳性细胞数明显减少，而电针组的阳性细胞数却一直维持较高水平，多于缺血再灌组(P＜0.05，见表2、图3、图4)。图3显示光镜下缺血再灌14天时皮质Synaptophysin免疫阳性细胞的表达，见Synaptophysin的免疫反应物主要分布于细胞膜与突起上，图4显示再灌14天时，电针组皮质Synaptophysin免疫阳性细胞明显多于缺血再灌组。

结果表明：脑缺血后GAP-43与Synaptophysin在脑内尤其在缺血灶周围皮质表达升高。而电针的累加效应不仅能促进它们进一步的表达而且能使之保持较长时间。

3讨论

GAP-43是一种分子量为43KDa的膜结合蛋白，主要分布于轴突生长锥以及突触前膜。在神经元发育和再生的轴突快速生长过程中GAP-43被大量合成，并被转运到轴突的生长锥以及未成熟的突触末梢，直至建立完整的突触联系后，GAP-43的水平才急剧下降。因此GAP-43是一种轴突出芽和突触再生的标志性蛋白。在分子水平上，GAP-43能与钙调蛋白相结合，可以被蛋白激酶C磷酸化从而具有活性，可以抑制磷脂酰肌醇磷酸激酶，可以激活轴突生长锥上GTP结合的Go蛋白，从而调节轴突的生长代谢。因此GAP-43可以作为一种内在的信号传导因子影响突触前膜的各种生理活动。GAP-43在轴突生长锥以及突触前膜的功能尚未完全清楚。目前已知 GAP-43 参与了轴突的生长及转运、靶细胞的识别、细胞排粒作用、神经递质的释放以及突触的建立、再生和功能的调节［1，2］。另外，GAP-43的磷酸化状态与 LTP 的建立和维持密切相关，从而影响到突触的可塑性。

Synaptophysin是一种分子量为38KDa的糖蛋白，定位于各种神经末梢的突触前囊泡上，它能有助于囊泡和突触前膜的融合以及神经递质的释放，并与突触的形成有关。由于囊泡的再循环，Synaptophysin 与其它几种囊泡蛋白持续存在于神经末梢。因此 Synaptophysin 表达情况可以反映突触的再生能力。缺血可以导致大范围的神经原死亡，使得梗死灶周围存活神经原失去神经支配，这将刺激轴突和树突分支，增加的分支增大了神经末梢的表面积，有利于树突和轴突的联系，以便形成新的突触。这种解剖的可塑性将导致神经原通路的改变。脑缺血不仅可以导致神经元的损伤而且可以改变神经的可塑性，研究证实缺血损伤可以刺激 GAP-43和Synaptophysin 在脑内的表达上调［3，4］。缺血损伤后，Golgi染色表明梗死灶周围存活神经元轴突和树突数目增加，轴突和树突的再生将使 GAP-43大量表达，因此，缺血后增加的GAP-43可作为梗死灶周围存活神经原轴突生长和出芽的有力证据。同样突触数量的增加将使突触囊泡和囊泡蛋白的数目增加，因此 Synaptophysin 也将大量表达。增加的Synaptophysin支持了缺血后梗死灶周围神经突触数目增加这一假说。

我们的研究发现 GAP-43 和 Synaptophysin免疫阳性细胞主要分布于皮质和纹状体上，且它们的免疫阳性物质主要定位于细胞膜和周围的突起，胞浆内未见染色，而文献报道胞浆与突起都可以有免疫阳性颗粒［5］，这可以用实验应用的抗体不同来解释。一些单克隆和多克隆的GAP-43抗体可以使锥体细胞的胞体和树突被染色，而另一些抗体则不然。另外，多克隆抗体由于特异性不高有可能与其它抗原结合，从而导致假阳性的发生，使结果被夸大。另一种原因为制备GAP-43抗体的抗原不同，可能为不同的动物来源，或同种动物在不同的时期被免疫 (如在胚胎期和成熟期)，所得到的抗体也有所差异，由此它反映的抗原分布也就相应的有所不同。

比较GAP-43和Synaptophysin表达时程，两者有所不同。在缺血再灌组，GAP-43在缺血后逐渐增加，一直持续到再灌后第14天。而Synaptophysin尽管同样在缺血后表达逐渐升高，但在缺血后第7天左右就达到了高峰，以后缓慢下降。而在电针组，它们的表达水平比缺血再灌组进一步提高，且能维持较长时间。这样更加有利于轴突的出芽和突触的形成，有助于缺血后功能的恢复。

电针使GAP-43和Synaptophysin在缺血后进一步表达升高的机制可能是多因素的。我们以前的实验证明电针能够使神经营养因子(BDNF和NGF)表达升高［6］。已有文献报道BDNF和NGF能够上调GAP-43和Synaptophysin的表达，并促进轴突的再生以及新的突触的形成。如BDNF能够提高外周神经系统GAP-43mRNA的表达［7］，而NGF不仅能增加GAP-43和Synaptophysin在脑内的合成，而且还可以使在轴突生长锥的GAP-43磷酸化［8］。而磷酸化的GAP-43具有很高的生物活性。

我们的研究支持了缺血后轴突出芽和突触再生的假设，进一步肯定了缺血后神经元在解剖上的可塑性，为中风后神经修复提供了分子的基础。由于轴突和突触的可塑性有利于缺血后功能的恢复，而电针作为一条能够提高其可塑性，从而促进功能恢复的有效手段被进一步证实，这将为脑缺血的电针治疗提供一条客观的理论依据。

4参考文献

1　Skene JH,Jacobson RD,Snipes GJ,et al.A Protein Induced During Nerve Growth Is A Major Component of Growth-cone Membranes.Science，1986；233:783

2　Strittmatter SM,Vartanian T,Fishman MC.GAP-43 As A Plasticity Protein in Neuronal form and Repair.J Neurobiol，1992；23:507

3　Kojiro K,Satoshi G,Shinji N,et al.Changes of Immunoreactivity for Synaptophysin Following A Transient Cerebral Ischemia in Rhe Rat Striatum.Brain Research， 1993；616:320

4　Satoshi G,Kazumichi Y.Increased Expression of GAP-43/B-50 Following Cerebral Hemitransection or Striatal Ischemic Injury in the Substantia Nigra of Adult Rats.Brain Research，1994；647:333

5　Paul R,Thomas A,Claire E.Neocortical Neural Sprouting,Synaptogenesis,And Behavioural Recovery after Neocortical Infarction in Rats.Stroke，1995；26:2135

6　陈英辉，黄显奋.电针对MCAO大鼠皮层神经营养因子表达的影响.中风与神经疾病杂志，2001；17(3)：139

7　Nao R,Kobabyyashi T,Dapeng F,et al.BDNF And NT-4/5 Prevent Atrophy of Rat Rubrospinal Neurons after Cervical Axotomy Stimulate GAP-43 And Tα1-tubulin mRNA Expression,And Promote Avonal Regeneration.J Neurosci，1997；17(24):9583

8　Mciri KF,Burdick D.NGF Stimulation of GAP-43 Phosphorylation in Intact Isolated Growth Cones.J Neurosci，1991；11:3155

(收稿日期：2001-05-15，齐淑兰发稿)