强胰降糖胶囊水提工艺研究

摘要：目的 优化强胰降糖胶囊的水提工艺。方法 以多糖提取率和葛根素转移率为指标，采用正交试验法考察加水量、提取时间、药粉粒径对提取效果的影响。结果 最佳水提工艺条件为药材粗碎全部过5 mm筛，加水提取2次，第1次加水10倍量，提取时间90 min，第2次加水6倍量，提取时间60 min。结论 该提取工艺稳定可行，可用于强胰降糖胶囊的生产。

关键词：强胰降糖胶囊；提取工艺；正交设计

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.12.019

中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）12-0050-04

Study on Water Extracting Technology of Qiangyi Jiangtang Capsules CHEN Ling-yun， DENG Ying， KANG Guo-jiao， LI Xuan-zhu （Pharmacy School of Yunnan TCM College， Kunming 650500， China）

Abstract：Objective To optimize the water extracting technology of Qiangyi Jiangtang Capsules. Methods With extraction rate of polysaccharide and transfer rate of puerarin as evaluation indexes， an orthogonal experiment of L9（34） was conducted， and water volume， time of decocting and particle size of medicinal materials were investigated. Results The optimum extracting condition was as follows： medicinal materials were pulverized coarsely and made it through 5 mm sieve， water was added to the the medicinal materials to decoct 2 times， the amount of water was 10 times and the decocting time was 90 min for the first time， the amount of water was 6 times and the decocting time was 60 min for the second time. Conclusion The extracting technology is reasonable and practicible， with good reproducibility， and can be used in the production of Qiangyi Jiangtang Capsules.

Key words：Qiangyi Jiangtang Capsules；extracting technology；orthogonal design

强胰降糖胶囊[滇药制字（Z）05A02584号]由葛根、黄芪、三七、丹参等10味药组成，具有强胰固本、降糖调脂等功效。为将其开发成六类中药新药，我们对其制备工艺重新进行了研究，即在原制剂制备工艺路线为基础，根据方中药物主要活性成分的理化性质，设计了水醇分组提取方案和全部水提方案，采用腹腔注射肾上腺素诱导小鼠高血糖模型对比了2种提取方案所得产品的降糖药效，最终选取了全部水提方案。本试验就其水提工艺进行优化研究。

1 仪器与试药

BT25S型电子分析天平（上海精密仪器仪表有限公司），高效液相色谱仪（Aglient 1100，四元泵，DAD检测器），DiKma C18-EP

基金项目：云南省科技厅重点新产品开发计划-社会发展部分（2008BC008）

通讯作者：李文军，E-mail：

色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）。WFZ UV-2000型紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司），SK250HP超声仪（上海科导超声仪器有限公司），DZKW-数显恒温水浴锅（上海天平仪器厂）等。

葛根等饮片均购自向辉生物科技有限公司。葛根素对照品（批号751-200810）、D-无水葡萄糖对照品（批号649-200001）均购自中国药品生物制品检定所，201-4型脱色树脂（长沙市大禹化工有限公司）。甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 评价指标及其测定方法

预试验结果表明，黄芪中的黄芪甲苷在干膏中的含量低于万分之一，梓醇的含量测定阴性有干扰，而葛根是方中君药之一，葛根素含量测定方法稳定可靠，专属性强；多糖是降血糖的有效成分，所以，本试验选取了多糖提取率与葛根素转移率作为评价指标。

2.1.1 多糖含量测定及方法学考察

2.1.1.1 葡萄糖对照品溶液的制备 取D-无水葡萄糖对照品约6 mg，精密称定，加蒸馏水溶解定容至50 mL，配制成0.126 mg/mL葡萄糖溶液，作为对照品溶液，备用。

2.1.1.2 供试品溶液的制备 按处方比例称取一倍处方量的葛根（20 g）、黄芪等药材，粗碎全部过5 mm筛，加适量水浸泡30 min后提取2次，第1次加水10倍量，提取时间90 min，第2次加水6倍量，提取时间60 min，过滤，合并滤液。滤液减压浓缩，浓缩液定容至1 000 mL。精密量取10 mL，置15 mL离心管中，加入氯仿-正丁醇（5∶1）溶液4 mL，搅拌，4 000 r/min离心20 min，取上清液滤过，精密量取续滤液2 mL，置15 mL离心管中，再精密加入无水乙醇10 mL，摇匀，冷藏2 h，取出，4 000 r/min离心20 min，弃去上清液，取沉淀加水20 mL使溶解，上至201-4型脱色树脂柱上（内径11 mm，柱高10 cm，湿法装柱，上样前用蒸馏水洗至中性），用200 mL水洗脱，收集洗脱液，加水定容至250 mL，即得供试品溶液[1-2]。

2.1.1.3 线性范围 精密吸取葡萄糖对照品溶液（0.126 mg/mL） 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于20 mL的干燥具塞试管中，补加蒸馏水使体积均至1 mL，另取1 mL蒸馏水作为空白对照。在各试管中分别加入5%的苯酚溶液2 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5.5 mL，充分摇匀，置于60 ℃恒温水浴中恒温30 min，取出，冰浴10 min，取出，放置10 min，立即用紫外分光光度计在490 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，样品浓度为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。结果回归方程为A=7.168 1C+0.025 1（r=0.999 6），表明在0.012 6～0.126 0 mg/mL范围内，葡萄糖的吸光度与其浓度呈良好的线性关系。

2.1.1.4 稳定性试验 取葡萄糖对照品溶液（0.126 mg/mL）和供试品溶液各1 mL，按“2.1.1.3”项下方法显色，冰浴10 min，立即倾入比色皿中，并分别于0、10、20、30、40、50 min测其吸光度。结果表明，随着放置时间延长，吸光度逐渐降低，在前20 min降低不明显，但在20 min后降低较多，因此，测定吸光度时，选择冰浴后放置10 min进行。

2.1.1.5 重复性试验 分别精密吸取葡萄糖对照品溶液（0.126 mg/mL）和供试品溶液各1 mL，按“2.1.1.3”项下方法显色并测定其吸光度，试验重复6次。结果对照品平均吸光度为0.813，RSD=0.41%，供试品平均吸光度为0.334，RSD=2.16%，表明重复性较好。

2.1.1.6 多糖的含量测定 取脱色后的供试品溶液1 mL，按“2.1.1.3”项下方法显色，在490 nm下测定吸光度，按标准曲线法计算供试品中总多糖含量。

多糖提取率（%）= 供试品液浓度（mg/mL）×125 ×100%

药材质量（g）

2.1.2 葛根素含量测定及方法学考察

2.1.2.1 葛根素对照品溶液的制备 取葛根素对照品适量，精密称定，加30%乙醇制成每l mL含0.042 mg的溶液，即得对照溶液。

2.1.2.2 供试品溶液制备 从“2.1.1.2”项下定容至1 000 mL的提取液中，精密移取1 mL置具塞锥形瓶中，置水浴锅上蒸干，精密加入30%乙醇溶液10 mL，称定重量，超声提取20 min，放冷后再称其重量，并用30%乙醇溶液补足减失的重量。过滤，滤液即为供试品溶液[3]。

2.1.2.3 阴性样品溶液制备 按处方比例称取1倍处方量除葛根以外的其他药材，按供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。

2.1.2.4 系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Dikma C18-EP，4.6 mm×250 mm，5 ?m），以甲醇-水（23∶77）为流动相，流速1 mL/min，柱温30 ℃，理论板数按葛根素峰计算应不低于5 000。分别取葛根素对照品溶液和供试品溶液各10 ?L注入液相色谱仪。结果表明，供试品葛根素与前后峰的分离度、拖尾因子均能满足2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥD高效液相色谱法项下规定。色谱图见图1。

A B

C

注：A.对照品；B.供试品；C.阴性对照

图1 强胰胶囊中葛根素HPLC图

2.1.2.5 阴性对照试验 取阴性样品液10 ?L注入液相色谱仪，采集色谱图，并与对照品、样品色谱图进行比较。结果表明，供试品的色谱图中，有一个色谱峰与对照品色谱峰的保留时间一致，而阴性对照的色谱图中在与对照品相同保留时间（±5%）位置上没有吸收峰，说明其他药物对葛根素的含量测定没有干扰，用本法测定葛根素的含量专属性较强、灵敏度高。

2.1.2.6 线性范围 精密称取葛根素对照品4.2 mg，加30%乙醇溶解并定容成100 mL（0.042 mg/mL），分别精密吸取对照品溶液1、2、5、10、15、20、25 ?L注入液相色谱仪，照上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。结果葛根素对照品的回归方程为A=3 977.1C-4.432 7（r=1），表明在0.042～1.05 ?g范围内，葛根素峰面积与进样量有良好的线性关系。

2.1.2.7 稳定性试验 取葛根素对照品、供试品适量，依法制备对照品溶液（0.042 mg/mL）和供试品溶液，于0、4、8、12、16 h，分别吸取10 ?L注入液相色谱仪，测定峰面积。结果显示，葛根素对照品峰面积RSD=0.69%，供试品的峰面积RSD=0.86%，表明葛根素和供试品溶液在16 h内保持稳定。

2.1.2.8 仪器精密度试验 分别精密吸取葛根素对照品溶液（0.042 mg/mL）和供试品溶液各10 ?L，重复进样5次，测定峰面积。结果显示，葛根素峰面积RSD=0.20%，供试品的峰面积RSD=0.29%，表明该仪器精密度良好。

2.1.2.9 重复性试验 取同一次提取液，精密移取6份，每份取1 mL，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进行含量测定。结果表明，6份样品葛根素平均含量为21.93 mg/mL，RSD=1.23%，表明本法具有较好的重复性。

2.1.2.10 加样回收率试验 精密量取同一次已知含量的提取液（含葛根素0.045 8 mg/mL）9份，每份2 mL，精密加入葛根素对照品溶液（0.086 mg/mL）适量（0.5、1、1.5 mL 3个不同水平，每水平3份），用30%乙醇定容成5 mL，摇匀，滤过，取续滤液测定葛根素含量，计算回收率。结果平均回收率为100.60%， RSD=2.04%。

2.1.2.11 样品测定 精密吸取供试品溶液10 ?L注入液相色谱仪，测定峰面积，按标准曲线法计算样品液浓度。

2.1.2.12 葛根药材中葛根素含量测定 取葛根药材粉末约0.1 g，精密称定为0.101 6 g，置锥形瓶中，精密加入30%的乙醇溶液50 mL，称定重量后加热回流30 min，放冷。再称定重量，用30%的乙醇溶液补足减失的重量。摇匀，滤过，取续虑液，即得药材供试品溶液。按上述色谱条件测定峰面积，用标准曲线法计算其含量。结果本试验所用药材中葛根素含量为37.15 mg/g。

葛根素转移率（%）= 样品液浓度（mg/mL）×10 000 ×100%

药材含量（mg/g）×药材质量（g）

2.2 正交试验

2.2.1 因素水平确定 影响水提取效果的主要因素有药材粉碎度、加水量、浸泡时间、提取时间、提取次数等，根据预试验结果及相关文献资料，以多糖提取率和葛根素转移率为指标，选择提取时间、加水量、药粉粒径3个因素，每个因素选择3个水平进行正交试验。因素水平表见1。

表1 正交试验因素水平表

水平 提取时间（min） 加水量（倍） 药粉粒径

A B C

1 90（ 60，30） 12（ 8，4） 饮片不粗碎

2 150（ 90，60） 16（10，6） 粗碎全部过5 mm筛

3 210（120，90） 20（12，8） 粗碎全部过4 mm筛

注：“粗碎全部过筛”是将饮片混合后，经粗碎机粗碎（不加筛网）后

过筛，不能过者再粉碎一次，直至全部通过

2.2.2 正交试验安排与结果 按处方比例称取一倍处方量的葛根等药材9份，混合粗碎，使全部过一定孔径筛网，置2 000 mL圆底烧瓶中，加适量水浸泡30 min，按表2所列条件回流提取，用0.125 mm（120目）筛过滤，滤液浓缩至约250 mL，用蒸馏水定容至250 mL。测定多糖提取率与葛根素转移率，不考虑交互作用，以综合评分为指标进行结果评价。综合评分多糖提取率和葛根素转移率的权重系数分别为0.5、0.5，二者均以最大者定为100分。正交试验结果见表2。

表2 水提取工艺正交试验安排与结果

试验号 A B C D 多糖提取

率（%） 葛根素转

移率（%） 综合

评分

1 1 1 1 1 6.46 39.97 42.25

2 1 2 2 2 16.04 68.02 86.56

3 1 3 3 3 17.62 60.01 86.21

4 2 1 2 3 12.08 82.87 84.28

5 2 2 3 1 17.12 72.28 92.19

6 2 3 1 2 8.56 46.40 52.29

7 3 1 3 2 13.68 57.62 73.61

8 3 2 1 3 10.52 69.37 71.70

9 3 3 2 1 13.52 44.38 65.15

均值1 71.67 66.71 55.41 66.53

均值2 76.25 83.48 78.66 70.82

均值3 70.15 67.88 84.00 80.73

R 6.10 16.77 28.59 14.20

2.2.3 正交试验结果分析 直观分析的极差结果显示，影响提取效果的因素顺序为C>B>A，即药材粉碎度是影响最大的因素，其次为加水量，提取时间影响最小。从均值来看最佳水提工艺条件为A2B2C3，因C因素的2水平与3水平的综合评分较为接近，考虑到药粉越细，过滤务困难，且杂质溶出增加，因此，结合生产实际，选用A2B2C2为强胰降糖胶囊的最佳水提工艺条件，即药材粗碎全部过5 mm筛，加水提取2次，第1次加水10倍量，提取时间90 min，第2次加水6倍量，提取时间60 min。方差分析结果见表3。结果表明，在所选水平范围内，各因素对试验结果无显著影响。

表3 正交试验结果方差分析表

方差来源 偏差平方和 自由度 均方 F值 显著性

A 60.497 2 30.25 0.190 P>0.05

B 525.962 2 262.98 1.653 P>0.05

C 1 386.466 2 693.23 4.357 P>0.05

误差e 318.250 2 158.38

注：F（2，2）0.05=19.00

2.2.4 验证试验 为保证优选的提取工艺合理可行，本试验对该工艺进行了3次验证。取一处方量葛根等药材145 g共3份，分别加水浸泡30 min，按A2B2C2提取，测定多糖提取率及葛根素转移率，结果见表4。多糖提取率与葛根素转移率均较高，接近预测值，工艺稳定，具重现性和可操作性，证明优选条件可行。

表4 提取工艺验证试验结果（%）

序号 多糖提取率 葛根素转移率

1 18.54 86.29

2 19.28 90.98

3 17.72 82.91

平均 18.51 86.73

3 讨论

影响水提取工艺的主要因素有药材粉碎度、加水量、浸泡时间、提取时间、提取次数等，在预试验中，考察了吸水率和浸泡时间，结果显示，在30 min时吸水率已基本达到饱和，吸水率为212.90%。预试验中还以采用单因素试验考察了上述主要因素对多糖提取率和葛根素转移率的影响，结果显示，本方饮片经粗碎后多糖提取率和葛根素转移率有明显提高，但粉碎至全部过2 mm筛后，会导致过滤困难；在加水总量均为20倍时，提取3次（8、6、6倍）的多糖提取率和葛根素转移率比提取2次（12、8倍）时略高，但均未超过5%，考虑到大生产时的操作方便，本文将提取次固定为2次。

文献报道的水提正交试验多以加水量、提取时间、提取次数为考察因素，所得最优结果中的每次加水量、提取时间均相同，这与生产实际情况并不相符，第1次加水时因饮片要吸收一定量的水，加水量应比第2次多。实际生产中的提取次数多为2～3次，宜用单因素考察进行确定，将其列为正交试验的考察因素会导致试验安排不便。结果表明，药材粗碎程度对提取有较大影响，因此，在本试验选取了药粉粒径、加水量、提取时间为正交试验的考察因素，而将提取次数固定。

由于本方中生地黄、葛根、白术等饮片均为厚片，混合粗碎后提取的多糖提取率和葛根素转移率明显高于用饮片提取，但干膏收率也明显提高，给后续的成型造成了一定困难。虽然在正交试验中选用粗碎后全部过不同孔径筛网作为不同水平，试验结果也能在一定程度上反映其差别，但也有不妥之处，因为只控制了最大粒径，并不能反映平均粒径，而粗碎时药粉粒径不可能均匀一致，饮片的含水量、粉碎操作等对药粉的平均粒径有较大影响，因此，药粉粒径水平的确定尚待进一步研究。

由于强胰降糖胶囊为中药复方制剂，处方中药味较多，成分较为复杂，影响因素较多。为更好地评价提取工艺，在前期的实验中，除选取葛根素转移率和多糖提取率外，还选取了黄芪甲苷转移率作为评价指标，但因黄芪甲苷含量较低（约十万分之三），影响其测定，因此，本试验只选取了葛根素转移率和多糖提取率作为评价指标。

文献资料显示，多糖具有明显的降血糖作用[4]，本方中黄芪等多味药的多糖含量均较高，为提高多糖提取率，本工艺中采用了水提，同时在工艺优选中选取了多糖提取率作为评价指标。在总多糖测定时，由于提取液颜色较深，影响测定结果，为此，在供试品溶液制备时采用了脱色树脂进行了脱色。

参考文献：

[1]李孝栋，陈景山，陈峰，等.黄芪多糖含量测定的方法学研究[J].世界科学技术-中医药现代化，2006，8（2）：35-37.

[2]韩燕全，黄正明，杨新波，等.苯酚硫酸法测定不同工艺六味地黄丸口服液中多糖的含量[J].药学学报，2008，24（4）：349-350.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：313.

[4]戴永强.中药复方免疫增强剂中活性多糖的分离纯化[D].石河子：石子河大学，2006.