HPLC法测定维A酸的平衡溶解度及表观油水分配系数

[摘要] 目的 建立HPLC法，模拟人体皮肤环境，测定维A酸在水、正辛醇中的平衡溶解度，以及在正辛醇-缓冲液体系中的表观油水分配系数。 方法 采用HPLC法测定维A酸的浓度，采用摇瓶法测定维A酸的表观油水分配系数。 结果 在32℃下，pH为5.8时，测得维A酸在正辛醇中的溶解度为6.25 mg/mL，在水中的溶解度小于0.1 mg/mL，维A酸的表观油水分配系数为36 079.8（lgP=4.55）。 结论 本文建立的HPLC法，可用于维A酸溶解度及油水分配系数的测定，该方法简便、准确。

[关键词] 维A酸；HPLC；平衡溶解度；表观油水分配系数

[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）01（b）-0099-03

维A酸又称维甲酸、视黄酸[1-2]，是维生素A的活性代谢中间产物[3]。维A酸为多烯酸结构的化合物，在光的影响下，易发生异构化反应，迅速转化为异维A酸[4-5]。维A酸可影响骨的生长和上皮代谢，能促进上皮细胞增殖分化和角质溶解[6]，亦起到抑制肿瘤、治疗痤疮和银屑病等作用[7-8]，目前已应用于临床，但关于维A酸的溶解度及油水分配系数的研究，国内外均鲜有报道。本文建立HPLC法，模拟人体皮肤环境，在32℃下，pH为5.8时测定了平衡溶解度及油水分配系数，为维A酸剂型的研究提供参考。

1 仪器与试剂

LC-10ATvp岛津高效液相色谱仪；HW-2000色谱数据处理系统；BT 125D电子分析天平；SK2510HP超声波清洗器；THZ-22台式恒温振荡器。

维A酸原料药（东北制药集团股份有限公司，批号：0311 203001）；维A酸对照品（美国SIGMA公司，批号：J1F266）。

甲醇为色谱纯；冰醋酸、正辛醇为分析纯；水为去离子水。

2 方法及结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取维A酸对照品12.5 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为维A酸对照品储备液。精密吸取对照品储备液2 mL，置50 mL棕色量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取维A酸供试品12.5 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为维A酸供试品储备液。精密吸取供试品储备液2 mL，置50 mL棕色量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.2 色谱条件及系统适用性试验

2.2.1 流动相的选择 《英国药典》“维A酸”流动相条件为：甲醇-水-冰醋酸（770∶225∶5）；《美国药典》“维A酸”流动相条件为：异辛烷-异丙醇-冰醋酸（99.65∶0.25∶0.1）；《中国药典》2010年版“维A酸”流动相条件为：甲醇-2%冰醋酸溶液（81∶19）。综合3种条件，以《中国药典》2010年版“维A酸”流动相为起始条件，进行试验，并在此基础上优化。结果见表1。

2.2.2 色谱条件的确定 以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），甲醇-水-冰醋酸（90∶10∶0.4）为流动相，检测波长为355 nm；流速为1.0 mL/min，柱温为40℃，进样量为20 μL。

在此色谱条件下，取适当浓度的维A酸对照品及供试品溶液20 μL注入液相色谱仪，理论塔板数按维A酸峰计不低于9 000，维A酸保留时间为13.4 min，拖尾因子为1.01，其杂质对主峰测定无干扰。结果见图1。

2.3 线性关系考察

称取维A酸对照品20 mg，精密称定，置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述溶液1、2、3、4、5 mL置于100 mL棕色量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液20 μL，注入液相色谱仪，以峰面积（A）对浓度（C）作线性回归，考察线性关系，并求得标准曲线方程。标准曲线方程Y=91 399X+18 088，r = 0.999 8（n = 5）。结果表明，在4.04～20.20 μg/mL的浓度范围内，峰面积与浓度的线性关系良好。

2.4 精密度试验

按“2.1.2”项下配制6份浓度为10 μg/mL的维A酸供试品溶液，平行进样6次，计算6份溶液的RSD值。结果表明，6份样品的RSD值为0.64%，说明本方法精密度好。

2.5 准确度试验

按“2.1.2”项下配制低、中、高3个浓度的维A酸供试品，溶液浓度分别为8、10、12 μg/mL。精密吸取供试品溶液，及“2.1.1”项下的对照品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以外标法计算供试品溶液中维A酸含量，并计算回收率。高、中、低3种浓度的准确度均好。结果见表2。

2.6 溶液稳定性考察

按“2.1”项下配制浓度为20 μg/mL的维A酸溶液及对照品溶液。分别于0、12、24 h时测定其含量，结果见表3。结果表明维A酸在甲醇-水-冰醋酸溶液中24 h内稳定性良好。

2.7 平衡溶解度的测定

2.7.1 水中的溶解度 称取维A酸20 mg，置具塞三角瓶中，加水500 mL，于恒温振荡器32℃下振摇24 h，静置12 h，分取上清液200 mL于分液漏斗中，加入1 mL二氯甲烷萃取，重复萃取两次。下层液置于2 mL容量瓶中。精密吸取供试品和对照品溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录峰面积。由外标法计算维A酸在水中的溶解度。经计算得维A酸在水中的溶解度小于0.1 mg/mL。

《中国药典》2010年版二部“维A酸”正文中对其溶解度的描述为：“在水中几乎不溶”，“几乎不溶”系指溶质1 g（mL）在溶剂10 000 mL中不能完全溶解，本试验所测结果与其描述一致。

2.7.2 正辛醇中的溶解度 称取维A酸50 mg置棕色量瓶中，加正辛醇10 mL溶解，32℃振摇24 h，静置观察，若维A酸完全溶解，则继续加维A酸，每次50 mg，32℃振摇24 h至溶液达到饱和，恒温静置12 h，精密吸取2 mL置50 mL棕色量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀；再精密吸取2 mL置50 mL棕色量瓶，加流动相稀释至刻度，摇匀。经外标法计算得维A酸在正辛醇中的溶解度为6.25 mg/mL。

2.8 表观油水分配系数的测定

人体皮肤pH值为4.5～6.5，平均5.75，体表温度32℃，为模拟人体环境，故选择pH 5.8的磷酸盐缓冲体系，并在32℃下进行试验。

2.8.1 水相的配制 按《中国药典》2010年版二部附录ⅩⅤ D配制磷酸盐缓冲液（pH=5.8）100 mL。油相为正辛醇溶液。

2.8.2 水饱和正辛醇溶液及正辛醇饱和水溶液的制备 分别量取60 mL油相和水相溶液置于分液漏斗中，32℃下振摇12 h，静置过夜。上层为磷酸盐饱和的正辛醇，下层为正辛醇饱和的磷酸盐缓冲液。

取维A酸12.5 mg，精密称定，置50 mL棕色量瓶中，加磷酸盐饱和的正辛醇溶解，并稀释至刻度，摇匀。精密吸取该溶液15 mL，精密吸取正辛醇饱和的磷酸盐溶液15 mL，置分液漏斗中，充分振摇，于32℃恒温静置至水相澄清。精密吸取上层油相2 mL至50 mL棕色量瓶中，以流动相溶液稀释至刻度，摇匀，作为油相供试品溶液。同时，精密吸取下层正辛醇饱和的水溶液20 μL作为水相供试品溶液。

精密称取维A酸对照品12.5 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀。继续精密吸取2 mL至50 mL棕色量瓶中，以流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

分别精密量取供试品溶液和对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。由外标法计算油相及水相中维A酸的浓度，分别记作C1，C2，按公式计算表观油水分配系数：Papp=C1/C2，lgP = lgC1/C2。其中，C1为药物分配平衡时，维A酸在正辛醇中的浓度，C2为维A酸在水中的浓度。经过外标法计算得，表观油水分配系数为36 079.8，lgP值为4.55。

3 讨论

3.1 流动相的选择

先通过调整甲醇和水的比例来选择最佳保留时间。当甲醇比例在81%～90%时，提高甲醇比例能大幅缩短主峰的保留时间，但当甲醇比例大于90%时，主峰保留时间略有缩短，分离度降低，但过小的保留时间不利于主峰前杂质完全分离。若保留时间过长，则造成分析效率降低、检测成本增加。综合考虑，选择甲醇-水的比例为90∶10。

再通过改变流动相中冰醋酸比例来调整峰型。将表1编号2、3、9，5、6，7、8号列为三组，比较同组的试验结果，可以看出，当冰醋酸比例变大时，可以缩短保留时间，主峰拖尾因子略微升高，但分离度降低，综合考虑冰醋酸比例还是0.4最佳。

因此，选择最佳流动相比例为：甲醇-水-冰醋酸（90∶10∶0.4）。

3.2 油水分配系数的意义

药物在体内的溶解、吸收、分布、转运与药物的水溶性、脂溶性有关，即和油水分配系数有关。药物要有适当的脂溶性，才能透过生物膜[9]，而水溶性有利于药物在体液内转运，达到作用部位与受体结合，从而产生药效，所以药物需要有适当的油水分配系数。

一般认为油水分配系数对数的最佳值，lgP在-1～2[10]。在此范围内，药物最易透皮。测量出的lgP大于2，表明本品属于强脂溶性药物（lgP > 4），不宜作透皮用，同时，鉴于维A酸的毒副作用，笔者不建议本药品透皮。因此，油水分配系数的测定对剂型的预测有一定的指导意义。

[参考文献]

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[5] 魏立明，宋霞，宋三孔，等.HPLC双波长法同时测定复方维A酸软膏中2主药的含量[J].中国药房，2012，23（8）：737-739.

[6] 袁华，封宇飞.48例维A酸不良反应文献分析[J].药物流行病学杂志，2011，20（7）：368-370.

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[9] 张锐，施，刘建群.HPLC法测定苜蓿素的表观油水分配系数[J].药物分析杂志，2011，31（9）：1815-1817.

[10] Alfred B，Donald J，Abraham. Burger’s Medicinal Chemistry and Drug Discovery [M]. New York：Wiley-Interscience，2003：249.

（收稿日期：2012-08-29 本文编辑：卫 轲）