时间：2022-02-10 07:07:13
摘要：目的构建重组羧肽酶原B甲醇酵母工程菌株。方法将羧肽酶原B编码基因整合入酵母质粒，电转化至甲醇酵母中，His缺陷培养基和G418抗性筛选获得阳性克隆株。用大肠杆菌表达的羧肽酶原B免疫家兔制备羧肽酶原B兔抗血清；经发酵、甲醇诱导后，蛋白质印迹（Western-blotting）免疫检测蛋白质的表达。结果获得高抗体滴度的羧肽酶原B兔抗血清，蛋白质印迹免疫检测重组酵母经甲醇诱导表达后的上清阳性。结论获得了重组羧肽酶原B甲醇酵母工程菌株，可分泌表达重组羧肽酶原B。
关键词：羧肽酶原B；甲醇酵母；表达；多克隆抗体制备；蛋白质印迹
中图分类号：Q556文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)11-0005-03
Construction and Secreted Expression of Recombinant Procarboxypeptidase B in Pichia pastoris
LI Su-xia, YUAN Qin-sheng
(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)
Abstract：Objective To construct the recombinant procarboxypeptidase B in Pichia pastoris. MethodsThe yeast plasmid containing procarboxypeptidase B coding gene was constructed, and then transferred to Pichia pastoris. The positive clone was obtained by G418 resistance selection in His- medium. The rabbit anti-rat recombinant procarboxypeptidase B serum was prepared with recombinant procarboxypeptidase B expressed in E. coli. Western-blotting analysis was used to determine the expressed protein with the prepared antiserum after fermentation and methanol induction of recombinant yeast. Results The rabbit anti-rat recombinant procarboxypeptidase B serum with higher antibody titer was got. The result of Western-blotting analysis showed that the supernatant was positive with the antiserum after methanol induction of recombinant yeast. ConclusionThe recombinant procarboxypeptidase B in Pichia pastoris can be constructed with the successful secretion of recombinant procarboxypeptidase B.
Key words：procarboxypeptidase B; Pichia pastoris; expression; polyclonal antibody preparation; Western-blotting
羧肽酶B（carboxypeptidase B，CPB，EC 3.4.17.2）是一种含锌的胰外肽酶，特异性水解肽链C端的碱性氨基酸：精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸，CPB含307个氨基酸，Mr约35×103。天然CPB由前羧肽酶原B（preprocarboxypeptidase B）产生，其N端包含108个氨基酸（其中13个氨基酸为信号肽序列，95个氨基酸组成活性肽部分）片段，并与C端的CPB相连，前羧肽酶原B在转运到内质网的过程中，信号肽被切掉，得不具有酶活性的羧肽酶原B（procarboxypeptiedase B，pCPB）从细胞中分泌，然后通过胰蛋白酶将其酶解为具有酶活性的CPB和活性肽部分[1]。目前，商业及研究所用的CPB均从动物胰腺提取，价格昂贵，且不能完全去除其他蛋白酶。重组CPB与生物提取的CPB相比，具有无动物源性、无其他蛋白酶混杂等特点。
pCPB可在大肠杆菌中表达，但是以包涵体形式存在，需经过超声波破碎细胞及包涵体复性等过程[2]。所以，我们尝试用甲醇酵母（Pichia pastoris）表达pCPB。甲醇酵母具有高等真核表达系统的许多优点，如蛋白质加工，蛋白质折叠和翻译后修饰等，并且能像大肠杆菌一样便于控制。目前许多蛋白质都可用甲醇酵母表达，例如阳离子依赖的甘露糖-6-磷酸受体、内毒素中和蛋白、马乳铁蛋白等在甲醇酵母中均得到了很好的表达[3]。本研究构建了pCPB重组酵母工程菌株，并用自制抗体对上清表达pCPB进行了蛋白质印迹检测。
1实验材料
1.1菌株与质粒
酵母菌株（Pichia pastoris）GS115（Invitrogen公司）。
质粒pPIC9K（Invitrogen公司）；p473-pCPB（中科院生物工程中心构建，本室保存）。
1.2培养基及相关试剂
1.2.1试剂蛋白胨，酵母提取物，酵母氮源（YNB）等购自Difco公司；各种氨基酸购自生工公司。
1.2.2培养基YPD培养液：2 % 蛋白胨，1 % 酵母提取物，2 %葡萄糖；SD培养基：1.34 %YNB，氨基酸，2 %葡萄糖；MM培养基：1.34 % YNB，4×10-5 %生物素，0.5 % 甲醇；MD培养基：1.34 % YNB，4×10-5 %生物素，2 %右旋糖酐；BMGY：1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，100 mmol/L磷酸钾，pH 6.0，1.34 %YNB，4×10-5 %生物素，1 %甘油；BMMY：1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，100 mmol/L磷酸钾，pH 6.0，1.34 %YNB，4×10-5 %生物素，0.5 %甲醇；10×混合氨基酸用量表（组氨酸缺陷）：L-缬氨酸（1 500 mg/L），L-异亮氨酸（200 mg/L），L-精氨酸（200 mg/L），L-赖氨酸（300 mg/L），L-甲硫氨酸（200 mg/L），L-苯丙氨酸（500 mg/L），L-苏氨酸（2 000 mg/L），L-酪氨酸（300 mg/L），L-尿嘧啶（200 mg/L），L-腺嘌呤半硫酸盐（adenine hemisulfate salt，400 mg/L），L-色氨酸（200 mg/L），L-亮氨酸（1 000 mg/L）。
1.3引物
pCPB-s3：5’-GCGGAATTC CAT GCT TCC GAG GAG CAC TTT GAT GGC-3’（含EcoR I 酶切位点和编码N端9个proCPB氨基酸）。
pCPB-a：5’-CGC AAG CTT TCA CTA ATA TAG ATG TTC TCG GAC ATA ATT-3’（含Hind III酶切位点和编码C端10个氨基酸）。
2实验方法
2.1pPIC9K-pCPB的构建
以本室构建的重组质粒p473-pCPB为模板[2]，用引物pCPB-s3和pCPB-a对模板进行PCR，胶回收后以Not I 和EcoR I 位点酶切将pCPB连接入同样酶切的质粒pPIC9K，测序鉴定pCPB基因以正确读框插入pPIC9K。
2.2pPIC9K-pCPB多拷贝重组子的筛选
用Sal I 酶切pPIC9K-pCPB线性化，用YPD培养甲醇酵母GS115至A600nm至1.2～1.5，按酵母质粒转化方法电击转化线性质粒pPIC9K-pCPB，于SD(His-)平板筛选，第2天至第3天可见含重组基因菌落出现。然后用含不同浓度G418的YPD平板筛选多拷贝重组子。
2.3GS115 pPIC9K-pCPB的诱导表达
选取2个较大的菌落分别接种至BMGY培养基中，第2天离心后倾去培养基，用无菌水洗涤1次，离心去上清，将菌体接入BMMY培养基，此后每天补加0.5 ％甲醇，96 h中每12 h取1 mL培养液离心，留取沉淀和上清样品。
2.4pCPB多克隆抗体的制备与滴定
溶解大肠杆菌表达的pCPB，加入免疫佐剂混匀后免疫家兔，于颈背部皮下、足垫点状多点注射，2周后加强1次，1月后再加强1次。1月后心脏取血，离心，得血清，即为兔抗鼠CPB抗体，将抗血清稀释至不同浓度，与二抗结合，显色，进行抗体滴定。
2.5蛋白质印迹检测pCPB在酵母中的诱导表达
将诱导后96 h的保存样品，破碎菌体后离心上清，与酵母诱导后的培养基同时电泳，转膜后进行蛋白质印迹检测。
3结果与讨论
3.1pPIC9K-pCPB的构建及pPIC9K-pCPB多拷贝重组子的筛选
SD(His-)平板筛选含有插入基因的重组甲醇酵母，第2天至第3天后可见含重组基因菌落出现。挑取较大的菌落至含0.25 mg/mL G418的YPD平板上，第2天再将能生长的菌落挑至含0.5 mg/mL G418的YPD平板上，依次挑取至含0.75，1.0，2.0 mg/mL G418的YPD平板上，最终选取2个菌落做诱导表达。
3.2兔抗大鼠重组pCPB的抗血清制备
用自制的标准重组CPB检测制备的抗血清，结果见图1。由图1可见，抗体稀释1∶5 000，可以得到清晰的明显特异显色的蛋白质印迹条带，表明抗体制备成功，而且抗体滴度较高。
M. 蛋白Marker；1，2，3分别为重组CPB的SDS-PAGE的结果（分别为5，10，15 μL CPB样品）；4，5，6分别为对应1，2，3的蛋白质印迹结果（所用抗体为自制兔抗重组大鼠pCPB抗血清，稀释梯度1∶5 000）
3.2酵母表达pCPB的蛋白质印迹检测
将2株重组酵母培养诱导后检测上清及对菌体行蛋白质印迹检测，结果见图2。由图2可见，4个样品经过蛋白质印迹验证（抗体1∶10 000稀释），在2号菌株诱导后培养液上清中杂出条带，45×103，为pCPB条带的位置，其余3个样品都没有杂出条带。因此，此菌株即为筛选到的阳性菌株。
M. 蛋白Marker；1. 酵母菌株1号菌体；2. 酵母菌株1号发酵后培养液；3. 酵母菌株2号菌体；4. 酵母菌株2号发酵后培养液；5，6，7，8分别对应于1，2，3，4的蛋白质印迹结果（所用抗体为自制兔抗重组大鼠pCPB抗血清，稀释滴度1∶10 000）
图2蛋白质印迹检测pCPB在酵母中的分泌表达
2002年以来，本实验室一直从事重组CPB的研究。利用重组大肠杆菌，分别从包涵体表达和可溶性表达两方面进行研究，包涵体表达蛋白经进一步复性、激活得活性CPB[2, 4]，上清表达的pCPB经激活、纯化后也得活性CPB[5]。本研究进行了pCPB酵母表达的尝试，得到了pCPB的重组酵母菌，为进一步利用该重组酵母制备重组CPB奠定了基础。
参考文献
[1]Burgos F J, Salva M, Villegas V, et al. Analysis of the activation process of porcine procarboxypeptidase B and determination of the sequence of its activation segment[J]. Biochemistry, 1991, 30(16): 4082-4089.
[2]Li S X, Zhang Y J, Tian L P, et al. Cloning, expression of a new procarboxypeptidase B gene in Escherichia coli and purification of recombination carboxypeptidase B[J]. Protein Pept Lett, 2003, 10(6): 581-590.
[3]王黎明，王琦，梅汝鸿．巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展[J]. 微生物学杂志，2004，24（2）：42-45.
[4]Zhang X Y, Li S X, Yuan Q S. The renaturation of pro-carboxypeptidase B by urea gradient gel filtration and some properties of recombinant carboxypeptidase B[J]. Protein Pept Lett, 2005, 12(7): 271-276.
[5]张映新，李素霞，杨梓，等．重组羧肽酶原B的上清表达及重组羧肽酶B的纯化[J]，药物生物技术，2006，13（2）：83-86.