舒血宁注射液的细菌内毒素检查方法探讨

[摘要] 目的：建立舒血宁注射液的细菌内毒素检查方法。方法：根据临床实际应用情况，合理地确定舒血宁注射液的内毒素限值。用不同厂家的鲎试剂与同厂家和不同厂家生产的舒血宁注射液分别进行干扰试验，考察舒血宁注射液对细菌内毒素检查的干扰作用，确定其最大无干扰浓度。结果：实验证明，舒血宁注射液稀释64倍后干扰作用完全消失，使用灵敏度为0.125 EU/ml的鲎试剂对其进行细菌内毒素检查，结果全部符合规定。结论：使用鲎试剂凝胶法检查舒血宁注射液的内毒素是可行的，可以用细菌内毒素检查法取代热原检查法。

[关键词] 舒血宁注射液；内毒素限值；细菌内毒素；鲎试剂；干扰试验

[中图分类号]R927.1[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2007）08（b）-095-03

舒血宁注射液为银杏叶经提取制成的灭菌水溶液，临床上主要用于缺血性心脑血管疾病，现行标准为卫生部药品标准规定的热原检查法[1]。热原检查法费时、费力、干扰因素多、结果重现性差，而采用细菌内毒素检查法，则可避免以上缺陷。本实验研究了用鲎试剂检查舒血宁注射液中细菌内毒素的可行性。

1 仪器与材料

SW-80A型旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）；电热恒温水浴箱（北京西城区医疗器械厂）；鲎试剂（TAL）（①湛江安度斯生物有限公司，批号0510026，灵敏度λ为0.25 EU/ml；批号0512082，λ为0.125 EU/ml；②湛江博康海洋生物有限公司，批号0606120， λ为0.25 EU/ml；批号0604110，λ为0.125 EU/ml）；细菌内毒素检查用水（中国药品生物制品检定所，规格：10 ml/支，批号200512）；细菌内毒素工作标准品（中国药品生物制品检定所，规格：120 EU/支，批号2005-3）；舒血宁注射液（神威药业有限公司，批号：06022212、06051412、05100411，规格：5 ml/支；黑龙江珍宝岛制药有限公司，批号20060411、20060215、2006080，规格：5 ml/支）

2 方法与结果

2.1 鲎试剂灵敏度复核

将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混合15 min，然后稀释成2.00λ，1.00λ，0.50λ，0.25λ 4个浓度等级，按细菌内毒素检查法[2]进行灵敏度复核试验和结果判断。4批鲎试剂灵敏度的测定值λc均在0.5λ~2.0λ之间，表明灵敏度符合规定，可用于试验。

2.2 细菌内毒素限值的确定[2]

细菌内毒素限值L=K/M。K为按规定的给药途径、人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂为5.0 EU/(kg・h) ；M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量。药品说明书的用法用量中规定，舒血宁注射液每日最大剂量为20 ml，用5%葡萄糖注射液250 ml稀释后使用，成人体重按60 kg计，计算L=5.0/20/60=15 EU/ml。

按上述方法求得的L值计算，以20 ml供试品与250 ml大输液的混合溶液量作为1 h的最大剂量，大输液内毒素限值(LGS)为 0.5 EU/ml。如果两者都为污染细菌内毒素接近限量的“合格”产品时，使人体（体重按60 kg计）接受细菌内毒素可能达到的理论总量P=(L×20 ml + LGS×250 ml)/60 kg=7.8 EU/(kg・h)。求得的P值大于5.0 EU/(kg・h)，说明联合用药时，患者接受内毒素的总量有可能超过人体的致热阈值，即便是“合格”产品也难免发生热原反应，故认为应按联合药液内毒素总量与人体致热阈值之间的关系来确定其内毒素限值[3]。

按联合用药内毒素总限量确定，按舒血宁注射液20 ml加5%葡萄糖注射液250 ml静脉滴注1 h计算，5%葡萄糖注射液的内毒素限值（LGS）为0.5 EU/ml；舒血宁注射液细菌内毒素理论限值为L1；混合药液的细菌内毒素总限量应不超过人体的致热阈值（k）5.0 EU/(kg・h)，即：（L1×20 ml＋LGS×250 ml）/60 kg≤k。由此得：L1≤(k×60 kg-LGS ×250 ml)/20 ml，即L1≤8.75 EU/ml。为了临床用药安全，我们认为将舒血宁注射液细菌内毒素限值定为8.0 EU/ml较为合适。

2.3 干扰试验的预试验

按照细菌内毒素检查法[4]进行干扰试验预试验，根据有效稀释倍数D=L/λ确定供试品的有效稀释倍数范围。现今我国市售TAL的灵敏度最高为0.03 EU/ml，最低为0.5 EU/ml。即Dmin＝8.0/0.5＝16；Dmax＝8.0/0.03＝267。以16倍为基准稀释倍数，用细菌内毒素检查用水倍比稀释得16，32，64，128，256倍系列稀释溶液，记为NPC系列。此外制备同样系列浓度的供试品阳性对照液，但每个浓度均含有2λ的内毒素溶液记为PPC系列。取λ=0.5 EU/ml鲎试剂分别与上述NPC和PPC系列溶液反应，并同时作阴性对照（NC）和阳性对照(PC)，结果见表1。

表1结果表明，阴性对照为阴性，阳性对照为阳性，试验有效。供试品对鲎试剂与内毒素的反应存在抑制作用，当供试品稀释倍数为64倍时才可能被消除（NPC两管为阴性，PPC两管为阳性），用不同厂家的鲎试剂检查结果一致，并以此稀释倍数进行正式干扰试验。

2.4 正式干扰试验

按《中国药典》2005年版二部附录中细菌内毒素检查法的干扰试验项方法进行试验和结果判断，分别用舒血宁注射液的64倍稀释液与细菌内毒素检查用水将同一支细菌内毒素工作标准品稀释成0.250，0.125，0.060，0.030 EU/ml两个系列浓度溶液，取TAL进行试验，并同时做阴性对照（NC）和供试品对照（TC）各2管，结果见表2。

表2结果表明，用细菌内毒素检查用水稀释的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值Es在0.5λ~2.0λ之间，且用供试品稀释液稀释的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值Et在0.5Es~2.0Es之间，说明供试品在64倍稀释后对细菌内毒素与鲎试剂的反应无干扰。

2.5 细菌内毒素检查方法验证

取6批供试品用细菌内毒素检查用水分别稀释64倍，使用灵敏度为0.125 EU/ml鲎试剂进行检测，结果6批供试品管及NC管均为阴性，PC管及PPC管均为阳性，细菌内毒素检查均符合规定，见表3。

3 讨论

按联合用药内毒素总限量确定舒血宁注射液的细菌内毒素限值L为8.0 EU/ml是较为合理的，能保证临床用药安全。

干扰试验结果表明，供试品稀释倍数小于32倍时有干扰抑制作用，当其稀释64倍后，干扰作用完全消失，由此可见，舒血宁注射液由热原检查法改为细菌内毒素检查法是可行的。

[参考文献]

[1]中华人民共和国卫生部药品标准. 中药成方制剂[S].第19册. 北京:化学工业出版社，1998.218.

[2]中华人民共和国国家药典委员会. 中国药典[S].二部.北京:化学工业出版社，2005.附录85.

[3]张玉武,陈桂新,邱汝先,等. 双黄连注射液细菌内毒素检查及其限值的确定[J].中国药学杂志, 2001, 36(6):403

[4]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规程[S].郑州:郑州大学出版社，2005.287.

（收稿日期：2007-05-22）

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