溶血磷脂酸对视网膜色素上皮细胞生物学的影响

【摘要】 目的研究溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid，LPA）对体外培养人类视网膜色素上皮（human retinal pigment epithelium，hRPE）细胞增殖活力、分化特性及免疫活性的影响。方法采用MTT法检测体外培养hRPE细胞增殖活力；细胞角蛋白及α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）免疫细胞化学染色方法分析体外培养hRPE细胞分化特性；流式细胞术检测hRPE细胞表面HLA-ABC、HLA-DR和ICAM-1的表达。结果 加药后第二天开始LPA组吸光度明显高于对照组（P 0.05），体外传代培养hRPE细胞细胞角蛋白表达减弱（F =92.28，P

【关键词】 视网膜色素上皮细胞；溶血磷脂酸；细胞增生；细胞分化；免疫活性

溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid，LPA）是一磷脂类生长因子，可刺激多种细胞增殖、延长细胞寿命、抑制细胞凋亡[ 1 ]。本文探讨LPA对体外培养hRPE细胞增殖活力、分化特性及免疫活性的影响，为进一步应用LPA促hRPE细胞体外增殖提供实验基础。

1 材料和方法

1. 1 标本来源角膜移植供体的健康成人眼球。

1. 2 主要仪器美国Forma CO2培养箱、苏州超净工作台、日本OLYMPUS倒置相差显微镜、Beckman-Coulter Epics XL 流式细胞仪、美国Metertech公司∑550型酶联免疫检测仪、太仓HZ-8211K恒温振荡仪、北京精利LCZ-5-2型低温自动平衡离心机。

1.3 试剂DMEM/F12培养基、胎牛血清、小牛血清、0.25％胰蛋白酶（均为Gibco公司）、PBS粉（Sigma）、鼠抗人细胞角蛋白-18单克隆抗体、鼠抗人α-SMA单克隆抗体（北京中杉公司），鼠抗人HLA-ABC单克隆荧光抗体（FITC标记）、鼠抗人HLA-DR单克隆荧光抗体（Pcy5标记）、鼠抗人ICAM-1单克隆荧光抗体（PE标记）（Coulter公司）。

1.4 hRPE细胞的取材和原代、传代培养参照Xu Guoxing[ 2 ]报告的方法。

1.5 LPA对hRPE增殖活力的影响hRPE增殖活力检测采用MTT法。实验分LPA组：DMEM/F12+10μmol/L LPA；对照组：DMEM/F12。取混匀的第2代细胞悬液按1.0×103/孔接种96孔板，每组6列。从接种后次日开始，每天将各组中的6孔细胞进行光密度值测定，共测7天，每天换液一次。测定时每孔内加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，继续培养4小时，终止培养后吸去孔内培养液，加入150μl二甲基亚砜（DMSO），混匀震荡15分钟，使结晶物充分溶解。选择490nm波长滤光片，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度。以时间为横轴，吸光度为纵轴绘制出细胞生长曲线。以上实验均重复3次，结果以表示，绘制生长曲线。

1.6 LPA对hRPE分化特性的影响分别用两种不同培养液（LPA培养液：DMEM/F12+10μmol/L LPA；普通培养液：DMEM/F12）在体外培养两个时间点（第3代和第5代）细胞爬片行细胞角蛋白、α-SMA免疫细胞化学染色（标准化的SP法）。hRPE细胞按2.0×105/瓶接种于25cm2培养瓶，每日换液，每8天传代一次（细胞汇合达80%左右），传代细胞按2.0×105/瓶再次接种于25cm2培养瓶。细胞爬片5天后取出盖玻片，在25℃室温下用PBS冲洗后4%多聚甲醛固定15min；PBS冲洗后加入1%TritonX-100破膜20min；PBS冲洗后加入3%H2O2灭活内源性过氧化物酶活性25min；PBS冲洗后加入羊血清封闭20min；加入一抗（鼠抗人细胞角蛋白-18单克隆抗体1:200稀释、鼠抗人α-SMA单克隆抗体1:75稀释）37℃ 湿盒孵育80min；PBS冲洗后加入二抗（生物素标记的羊抗鼠IgG抗体）37℃ 湿盒孵育30min；PBS冲洗后加入链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶37℃ 湿盒孵育30min；PBS冲洗后直接DAB显色6min，苏木素复染，中性树胶封片。结果采用Image8000彩色图像分析仪对各组细胞免疫组化爬片进行分析，方法如下：每组各取6张爬片，用计算机－图像分析仪将免疫组化爬片图像通过图像采集系统以×40物镜输入，每张切片图像各随机采集10幅，对图像中阳性反应部位（胞质）进行平均灰度和面密度分析。记录相应数据，取其平均值作为该标本的结果。

1.7 LPA对hRPE免疫活性的影响hRPE免疫活性采用流式细胞仪检测hRPE细胞表面HLA-ABC、HLA-DR、ICAM-1的表达。实验分LPA组： DMEM/F12+10μmol/L LPA；对照组：DMEM/F12。取第2代细胞接种培养瓶，每天换液一次，6天后吸除瓶内旧培养液， PBS液润洗培养瓶后再加5ml0.04%的EDTA的PBS液进行消化37℃ 30min（至贴壁细胞间出筛状间隙为止），用细胞刮将细胞自瓶壁上轻轻刮下吹散并移入离心管，短时低速离心，弃上清，加10%鼠血清PBS液（封闭非特异性结合位点）1ml吹打5min后静置30min，并短时低速离心，弃上清，加PBS液3ml将细胞吹打均匀，用300目尼龙网过滤成单细胞，短时低速离心，加标记的抗体在恒温振荡仪（26℃，80 r/min）上染色30min，短时低速离心，弃上清加入0.4mlPBS上机测定。测量其阳性细胞率和平均荧光强度。结果以表示。

1.8统计学处理

统计数据采用SPSS11.0统计软件处理，以P

2、结果

2.1 LPA明显促进hRPE的增殖活力加药后第二天开始LPA组吸光度明显高于对照组（P

2.2 LPA对hRPE转分化无影响、体外传代培养促进hRPE细胞转分化体外培养时hRPE细胞变得更为扁平，按一定方向生长，细胞融合时呈梭长形，类似纤维样细胞。细胞免疫组织化学染色计算机图像分析结果见表2.1（细胞角蛋白18）和表2.2（α-SMA）。

2.3LPA对hRPE免疫活性无影响采用流式细胞仪检测hRPE细胞表面HLA-ABC、HLA-DR、ICAM-1的阳性细胞率见表2.1和平均荧光强度见表2.2。

3 讨论

3.1溶血磷脂酸(LPA)及其受体的生物学特征、信号传导途径及生物学功能

LPA不仅是细胞内磷脂重新生物合成的中间产物，而且是磷脂类生长因子家族中的一员。LPA通过自分泌、旁分泌、内分泌途径存在于血清、房水、泪液等[ 1、3 ]。溶血磷脂的G蛋白偶联受体是由lp基因编码的，目前已知有8种膜受体， hRPE细胞表面主要表达LPA1[1]。LPA与其受体结合促进细胞增生，细胞寿命延长，抑制凋亡，调节细胞因子表达，可参与生长发育，伤口愈合以及组织再生等许多重要的生物活动[ 1、4、5 ]。

3.2LPA明显促进hRPE的增殖活力的机制

研究发现加药后第二天开始LPA即可明显地促进体外培养的hRPE细胞的增殖活力。LPA与hRPE细胞表面LPA1受体结合后激活Gi蛋白抑制细胞内cAMP的合成，同时活化Ras蛋白，活化的Ras蛋白激活下游一个高度保守的蛋白激酶级联系统---MAPK（促分裂原活化蛋白激酶途径）――从而激活MAP激酶，激活的MAP激酶可活化其靶蛋白：包括某些蛋白激酶，胞质蛋白及调节细胞周期和分化的转录因子等，部分细胞还刺激PKC；激活Gi蛋白还可刺激hRPE细胞产生一个内向的钙离子流和一个外向的钾离子流；激活G12蛋白参与细胞膜上的Na+／H+交换，使胞浆pH碱化[ 1、3、6、7 ]。细胞内pH碱化，Ca2+浓度增加以及蛋白质的磷酸化都是细胞增殖分裂不可缺少的条件。

3.3LPA对hRPE转分化的影响

体内hRPE细胞间及细胞及胞外基质之间存在大量的细胞连接及神经内分泌系统，通过相关基因的表达调控保持细胞的分化特征。当细胞离体培养后，hRPE细胞失去上述体内联系。这引起细胞形态和功能都发生一定程度的改变。细胞首先出现不适应，即细胞失去原有组织结构和细胞形态，上皮细胞极性消失，分化减弱或不显，这是由于环境的改变而出现的变化；随着细胞在体外培养时间延长，细胞将发生转分化，即细胞失掉原先的分化能力而转化成类其他胚层的细胞，表达一些原先不表达的蛋白，这是基因变异所致。研究发现[ 8-12 ]体外传代培养时hRPE细胞极性逐渐消失，细胞变扁，按一定方向生长，细胞融合时呈梭长形，类似纤维样细胞。上皮细胞特征性细胞角蛋白表达减弱；并出现正常hRPE细胞中不表达的α-SMA。α-SMA是一个肌细胞分化的标志，正常表达在平滑肌和心肌细胞，是细胞的一种收缩成分。这提示体外传代培养的hRPE细胞可能在术后PVR形成过程中起一定作用。LPA对hRPE细胞转分化无影响，应用LPA促进hRPE细胞体外增殖可以大大缩短体外培养时间，从而可在hRPE细胞转分化前获取大量细胞用于研究及临床应用。

3.4LPA对hRPE免疫活性的影响

本研究发现LPA作用下hRPE细胞表面HLA-ABC、HLA-DR、ICAM-1的阳性细胞率和平均荧光强度改变均无统计学意义。HLA-抗原是人类的主要的组织相容性抗原，在免疫系统调节和组织器官移植免疫排斥中起重要作用。ICAM-1类分子是HLA-抗原参与免疫应答所需的粘附分子。这提示LPA对hRPE免疫活性无影响。

体外培养获取大量的正常的hRPE细胞是进行研究和移植的首要条件。尽管培养技术的不断发展，细胞可以在人工培养条件下生存、生长和增殖，但体外培养环境与内环境相比仍然存在着较大的差异。本文研究LPA对体外培养hRPE细胞增殖活力、分化特性及免疫活性的影响，为今后进一步应用LPA促hRPE细胞体外增殖及应用LPA治疗视网膜色素上皮变性性疾病提供实验基础。

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