大黄素抑制胰腺癌裸鼠原位移植瘤的实验研究

摘 要：目的：观察大黄素（Emodin）对胰腺癌裸鼠原位移植瘤生长、转移的抑制作用并探讨其机制。方法：建立胰腺癌裸鼠原位移植瘤模型（SOI）,随机分为对照组、实验Ⅰ组、实验Ⅱ组等3组（n10），第3周开始分别经灌胃给予溶媒（0.1%二甲基亚砜）0.2mL/只、大黄素 20mg/kg、大黄素 40mg/kg，每周3次，共两周。术后第8周处死裸鼠，测量原位肿瘤瘤重并计算抑瘤率；观察荷瘤裸鼠肿瘤转移情况；免疫组织化学法检测肿瘤组织的增殖指数（ PI）、微血管密度（MVD）以及金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达。结果：与对照组相比，实验Ⅰ组肿瘤生长未受明显抑制，但转移明显被抑制；实验Ⅱ组肿瘤生长和转移均受显著抑制；实验Ⅰ、Ⅱ组肿瘤组织中PI、MVD及MMP-9的表达均明显降低。结论：大黄素具有抑制胰腺癌裸鼠原位移植瘤生长和转移的作用，这可能是通过抑制胰腺肿瘤MMP-9的表达而实现。

关键词：胰腺肿瘤；大黄素；转移

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717（2011）04-0770-03

Abstract:Objective:To investigate the antitumor and anti-metastasis effects of emodin on the model of human pancreatic carcinoma established by surgical orthotopic implantation （SOI） in nude mice. Methods: After 3 weeks of implantation, the SOI model were randomized into 3 groups （n 10）: Control group, feed with 0.1% Dmethyl sulfoxide（DMSO）0.2mL/D Test group Ⅰ, Emodin at dose of 20mg/kg Test group Ⅱ, Emodin at dose of 40mg/kg. All treatment lasted for two weeks, thrice per week. Eight weeks after implantation, tumor weight, inhibition rate, and the presence of metastasis were evaluated respectively after the mice were sacrificed. Immunohistochemistry was used to detect the positive expression of ki-67, CD34 and MMP-9 in the tumors. Results:The rate of metastasis in test group Ⅰ was significantly lower than the rate in control group. In test group Ⅱ,both the rate of metastasis and the tumor weight were significantly lower than those in control group. The positive expression of ki-67, CD34 and MMP-9 in the tumors of two test groups were significantly lower than those in control group. Conclusion:Emodin has the antitumor and anti-metastasis effects to the human pancreatic carcinoma in nude mice and those effects may be related to the down-regulation of MMP-9.

Key words:emodin pancreatic neoplasm metastasis

蒽醌类化合物大黄素（Emodin，6-甲基-1，3，8-三羟基蒽醌）为大黄等中药的有效成分，具有如抗炎、抗肿瘤、免疫调节、保护肝脏等多种生物活性作用【sup】［1］【/sup】。具体在抗肿瘤方面，有多个研究表明，大黄素在体外可抑制胰腺癌、卵巢癌、肺癌和白血病等多种恶性肿瘤细胞生长【sup】［2］【/sup】。本研究通过建立胰腺癌裸鼠原位移植模型（SOI），观察大黄素在裸鼠体内对胰腺原位移植瘤生长、转移的抑制作用及其对肿瘤血管生长的影响，旨在探讨大黄素体内抗胰腺癌的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

大黄素（批号：E7881）及溶媒二甲基亚砜（DMSO）均购自美国Sigma公司；胎牛血清（FBS）、含EDTA胰酶和RPMI-1640培养基等购自美国Gibco公司；MMP-9抗体（批号：2551-1）购自美国Epitomics公司；ki-67和CD34抗体购自北京中杉金桥生物技术公司。

1.2 实验动物

4至6周龄健康BALB/c雌性小鼠，体重18～20 g，购于中科院上海实验动物中心，饲养于SPF（无特定病原体）级屏障系统的洁净层流架内，控制室温在（25±1）℃，相对湿度40%～60%。

1.3 药物配制

溶媒DMSO稀释成浓度为0.1%，用于对照组给药。大黄素用溶媒DMSO溶解配制成含0.2%大黄素、0.1%DMSO及含0.4%大黄素、0.1%DMSO的两组药物分别用于实验Ⅰ组和实验Ⅱ给药。

1.4 细胞培养

人胰腺癌细胞株SW1990购自ATCC，培养在含体积分数l0%的胎牛血清、质量浓度100 ug・mL【sup】-1【/sup】青霉素和100 ug・mL【sup】-1【/sup】链霉素的RPMI 1640培养液中，培养条件为37℃、体积分数5%的CO【sub】2【/sub】、饱和湿度。细胞单层贴壁生长，至70%～80%融合时胰蛋白酶消化传代。

1.5 胰腺癌裸鼠胰腺外科原位移植模型（SOI）的建立和给药方案

皮下移植瘤制备：2×10【sup】6【/sup】个指数生长期的SW1990细胞行裸鼠皮下注射，待生长成1cm【sup】3【/sup】皮下移植瘤后取出，无菌条件下去除中央坏死组织，选取周围健康肿瘤组织剪成1 mm【sup】3【/sup】的组织块。

外科原位移植模型制备：戊巴比妥钠（50 mg/Kg）腹腔麻醉裸鼠，左上腹直肌旁切口，暴露脾脏和胰尾，剪开胰腺被膜，将瘤块植入胰尾近脾动脉处，缝合胰腺被膜。共制备30只裸鼠。

给药方案：3周后模型动物随机被分为对照组、实验Ⅰ组、实验Ⅱ组，于术后第3周起分别经灌胃给药（3次/每周，共2周）：溶媒（DMSO）0.2mL/只、大黄素20 mg・kg【sup】-1【/sup】、大黄素40 mg・kg【sup】-1【/sup】。

术后第8周处死模型动物，取胰腺肿瘤组织，称重并计算抑瘤率（抑瘤率（1―治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重）×100%）。并留取胰腺肿瘤、肠、肝脏、腹壁和肾，标本连续切片，HE染色，确定转移范围。

1.6 免疫组织化学法检测Ki-67 CD34和MMP-9,观察PI、MVD及MMP-9的表达

免疫组化采用EnVison法：取肿瘤组织切片，常规脱蜡、水化，微波处理后分别加稀释的Ki-67、CD34和MMP-9抗体为一抗，孵育60 min，再加二抗，孵育30 min，DAB显色，苏木精套染，透明，封片后待检。

在高倍镜（400×）随机选择20个视野，计算镜下Ki-67阳性细胞所占比例，即为细胞增殖指数（PI）；低倍镜（100×）下寻取血管密度最高的区域，然后高倍镜（400×）下随机选择20个视野，计数每个视野中CD34阳性细胞数，即为微血管密度（MVD）；在高倍镜（400×）随机选择20个视野，计算镜下MMP-9阳性细胞所占比例，定量MMP-9在胰腺癌中的表达。

1.7 数据的统计处理

应用SPSS 11.0统计软件进行方差分析和卡方检验，实验所得计量数据以均数±标准差（±s）的形式表示，P

2 结 果

2.1 大黄素对裸鼠胰腺癌原位移植瘤生长的影响

实验中，对照组有一只裸鼠死于恶液质；实验组用药期间部分出现稀便，疗程结束后好转。处死模型裸鼠后分离胰腺肿瘤,称重。与对照组裸鼠瘤重（1.651±0.404）g相比，实验Ⅰ组瘤重（1.442±0.387）g降低无显著意义，抑瘤率仅为12.7%；实验Ⅱ组裸鼠瘤重（1.215±0.452）g明显降低（P< 0.05），抑瘤率为26.4%。见表1。

表1 大黄素对体内胰腺癌生长和转移的影响

注：与对照组相比较，*P< 0.05。

表2 大黄素对裸鼠胰腺肿瘤中

PI MVD和MMP-9表达的影响

注：与对照组相比较，*P

图1 免疫组织化学法检测大黄素对

裸鼠胰腺癌原位移植瘤中Ki-67、CD34和

MMP-9表达的影响（×400）

2.2 大黄素对裸鼠胰腺癌原位移植瘤转移的影响

模型尸检以及HE染色证实，对照组裸鼠胰腺肿瘤发生多发转移，转移部位多见于肠、肝、腹壁和肺；两实验组荷瘤裸鼠中，胰腺肿瘤转移明显被抑制（P< 0.05），有转移者转移灶多局限于腹壁。见表1。

2.3 大黄素对裸鼠肿瘤组织Ki-67、CD34及MMP-9蛋白表达的影响

免疫组织化学染色可见对照组肿瘤组织中大量细胞Ki-67、CD34及MMP-9阳性表达；两实验组肿瘤组织中Ki-67、CD34及MMP-9阳性细胞均明显减少见图1，与对照组相比较，差异有统计学意义（P< 0.05），见表2。

3 讨 论

胰腺癌是一种预后很差的消化道恶性肿瘤，即便作为治疗进展期胰腺癌首选化疗药物的吉西他滨，治疗的总有效率也小于20%，且无明显的抗转移作用【sup】［3-4］【/sup】。研究表明大黄素在体外可抑制多种恶性肿瘤细胞生长，但大黄素在体内对恶性肿瘤的生长、转移方面的研究却鲜有报道。因此，笔者通过建立裸鼠人胰腺癌外科原位移植模型（SOI），观察不同剂量大黄素对胰腺癌裸鼠原位移植瘤生长和转移的影响并初步探讨其机制。

分析本研究结果可知，原位移植8周后，高剂量大黄素组裸鼠胰腺肿瘤的瘤重明显低于对照组，细胞增殖指数（PI）明显下降，且转移率亦有明显降低，有转移者转移部位也多局限于腹壁；低剂量大黄素虽未能显示明显抑制胰腺肿瘤的生长，但能显著抑制其转移，且PI值也有明显下降。故表明一定剂量的大黄素在裸鼠体内能显著抑制胰腺移植瘤的生长和转移。

新生血管形成是由一系列步骤组成的生物学过程，在机体伤口愈合、炎症反应和月经等生理过程中存在但被严格限制着。而在肿瘤侵袭和转移中，新生血管形成扮演着极为重要的角色，一旦肿瘤长到拥有诱导血管生长的能力，肿瘤生长就变得极富有侵犯性，从而为肿瘤侵袭和转移提供便利和可能【sup】［5］【/sup】。而通过抑制肿瘤血管生长、破坏肿瘤血供可抑制肿瘤生长和转移【sup】［6］【/sup】。既往多个研究表明，大黄素可抑制多种血管内皮细胞增殖及其功能，具有抑制血管生长的生物学效应【sup】［7,8］【/sup】。本研究中，我们通过微血管密度（MVD）来评价胰腺移植瘤中血管生成程度，结果表明，相对于对照组，实验组中胰腺肿瘤中MVD均有显著下降，表明了一定剂量的大黄素能够抑制胰腺肿瘤血管生长，与相关文献报道相符。因此，可以推断抑制血管生长在大黄素体内抑制胰腺移植瘤生长和转移中发挥了一定的作用。

肿瘤侵袭和转移是一个多因素、多步骤的生物学过程。在肿瘤转移过程中，金属蛋白酶（MMPs）家族在促进肿瘤细胞迁移、细胞外基质降解和肿瘤远处转移等生物学行为中过程中发挥了关键作用，尤其是MMP-9被认为不仅在降解细胞外基质蛋白中扮演着重要角色，而且MMP-9还可调控血管内皮生长因子（VEGF），与肿瘤新生血管形成相关，从而在肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用【sup】【/sup】［9,10］。因此，抑制MMP-9在肿瘤中表达可有效抑制肿瘤侵袭和转移。既往已有研究指出，大黄素可下调皮肤癌细胞中MMP-9的表达【sup】［11］【/sup】。而在本研究中，我们也观察到了一定剂量的大黄素能下调裸鼠胰腺癌原位移植瘤中MMP-9的表达。因此，可以认为在大黄素抑制胰腺肿瘤的转移和血管生长的过程中，抑制MMP-9的表达可能是其重要途径。

临床实践中，抗肿瘤血管生成药物sorafenib和sunitinib在用于治疗转移性肾癌中均已取得了满意的疗效【sup】【/sup】［12,13］，而本研究不仅表明大黄素在裸鼠体内的抗胰腺癌原位生长、转移作用，还在分子水平上表明大黄素可以抑制裸鼠胰腺肿瘤组织中CD34和MMP-9的表达，抑制肿瘤血管生长。因此，若加以进一步的研究，大黄素可望成为治疗胰腺癌新的化疗药物。

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