脾虚证荷瘤小鼠模型的建立

摘 要：目的：利用泻下加劳倦过度方式结合皮下接种H-22肝癌细胞的模式造成脾虚型荷瘤小鼠模型。方法：16只昆明小鼠随机分为对照组和模型组,每组8只，10天后取食量、体重、肛温、腹泻、污秽、拉尾排便次数、悬空拉尾抵抗时间及一般状况（拱背、毛色枯槁及脱毛、倦卧嗜睡等），作小鼠脾虚征象详情记录。取血测定血清D-木糖醇、血清胃泌素、处死剖取胸腺、脾脏称重，计算胸腺指数和脾脏指数,评价模型的建立和病理生理特点。结果：造模后，造模小鼠腋下均长出肿瘤结节，并且出现明显食少、稀便、污秽、神软萎靡、喜聚堆倦伏、毛色枯槁、拱背竖毛、活动缓慢、反应迟钝等脾虚证状，以第6天最显著。结论：泻下加劳倦过度方式结合皮下接种H-22肝癌细胞的模式在小鼠体内可以成功建立病证结合的脾虚证荷瘤模型。

关键词：疾病模型；病证结合；肿瘤；小鼠

中图分类号：R332 文献标识码：A 文章编号：1673-7717（2011）04-0767-03

Abstract:Objective:With the method which is combined with purgation and excessive fatigue and the mode of hypodermic inoculation of H22 hepatic carcinoma cells to establish the tumor-bearing mice models with Spleen Deficiency.Method:A total of 16 mice were randomly divided into the control group and the model group, with eight in each group.10 days later, conditions of appetite，weight，rectal temperature，diarrhea，excrement around the anus，times of defecation when pulling the tails，time length of resistance when pulling the tails hang in the air and general conditions（arch back，withered and yellow coats，unhairing，lassitude and drowsiness and so on ）were recorded in detail as the symptoms of spleen deficiency. 3Get blood for the Determination of serum D-xylitol and gastrin（GAS）.And the mice were sacrificed, weigh the mice's thymuses and spleens and calculate the thymus index and spleen index, evaluate the establishment of the model and Pathophysiologic Characteristics. Results :4It showed that after establishing the models, each mouse in model group grows tumor nodules in axillary region. And accompanied with apparent spleen-deficiency symptoms such as poor appetite, loose stool, excrement around the anus, lassitude ,tend to rest in groups, withered and yellow coats, arch its back and piloerection, slow-moving, bad-response, especially marked at the sixth day.Conclusion: 5the method combined with purgation and excessive fatigue and the mode of hypodermic inoculation of H22 hepatic carcinoma cells can set up tumor-bearing spleen deficient mice models with combination of disease and syndrome.

Key words:disease modelcombination of disease and syndrome tumormice

动物移植性肿瘤模型是目前中医药抗肿瘤疗效研究的重要方法之一。小鼠肝癌（H22）模型做为一种重要的肿瘤移植性模型，近年来被大量应用于肿瘤基础研究及药物筛选,成为研究中医药抗肿瘤的作用及机制的一个公认的肿瘤模型，国内外广为采用而且获得了较好的结果【sup】［1］【/sup】。根据病证结合的理念,建立肿瘤的病症结合的疾病模型目前尚处于探索阶段。本研究通过泻下加劳倦过度方式结合皮下接种H-22肝癌细胞的模式,建立小鼠脾虚型荷瘤模型,从动物一般情况、悬空拉尾抵抗时间、血清D-木糖醇、血清胃泌素、胸腺指数和脾脏指数等多角度论证模型的特征。

1 材料和方法

1.1 试剂

胃泌素放射免疫分析药盒，为北京原子高科研究所产品，批号：050120；0.9%生理盐水注射液，为浙江省医药股份公司新昌制药厂产品，批号：20041201；5%葡萄糖注射液，为杭州民生制药厂产品，批号：10501273；间苯三酚试剂，60ml×3瓶，为南京建成生物工程研究所产品；13.3mmol/L（2g/L）D-木糖标准品储备液2ml×1支，为南京建成生物工程研究所产品；标准品稀释10ml×1支，为南京建成生物工程研究所产品。

1.2 动物与分组

5～7周龄昆明种小鼠（雄），体重（23±2）g，清洁级，均由浙江中医药大学医学实验动物中心代购。小鼠群养，每笼5只，实验期间自由饮食，标准饲料由浙江中医药大学医学实验动物中心提供。实验室室温18℃～22℃，相对湿度70%。小鼠肝癌细胞株H-22，购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.3 动物模型的制作

1.3.1 细胞培养和传代 培养条件：10%小牛血清RPMI-1640培养液、5%CO【sub】2【/sub】恒温孵育箱、温度为36.5℃，湿度为100%。从细胞库中取出原代H-22细胞株，37℃下融解，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加入5mL培养液，混合后1000r/min离心,5min后弃上清液，所余肿瘤细胞用RMPI-1640培养液（含15%灭活小牛血清）稀释后，接种于培养瓶，在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度培养箱内进行培养，细胞呈半贴壁生长，细胞呈指数生长。一部分调整浓度为5×10【sup】6【/sup】/mL，台盼蓝染色活细胞计数>99%，准备实验用；另一部分继续换液传代培养。

1.3.2 脾虚模型动物模型的建立【sup】［2］【/sup】 脾虚模型采用泻下加劳倦过度方式，具体方式为昆明每天小鼠游泳2～5 min，以身体下沉为度，每日1次，且施100%番泻叶煎剂每日0.5mL/只灌胃，共6天造成脾虚模型。

1.3.3 腹水瘤模型的建立与传代 收集体外培养的对数生长期的H-22肝癌细胞，制成细胞混悬液，调节细胞数为 1×10【sup】7【/sup】/L,将H-22肝癌细胞悬液接种到5只昆明鼠（18-22g）腹腔内供传代用，每只昆明鼠接种0.2mL。7天至10天左右,将全身状况良好的H-22荷瘤鼠处死，无菌条件下取出腹水，以生理盐水制备癌细胞悬液，稀释成1∶3的瘤细胞悬液，将烧杯置于冰块上，调成瘤细胞悬液浓度为1×10【sup】7【/sup】个瘤细胞/mL，将烧杯置于冰块上。选取中医证候造模已完成的昆明小鼠，用1 mL注射器抽吸瘤细胞悬液，每次抽吸前将瘤细胞悬液混匀，用酒精棉球消毒小鼠右侧腋窝皮肤后，每只小鼠皮下接种瘤细胞悬液0.2 mL。

1.4 指标检测与方法

1.4.1 一般情况 小鼠造模后隔日称重。造模后第1天开始给药。及时记录小鼠活动、体态、毛色、饮食、排便以及其他变化。隔日观察各组小鼠体重变化。

1.4.2 对肿瘤生长的影响 观察造模组小鼠接种部位皮下结节情况；造模组分别于实验第14天（即末次给药后24小时）脱颈椎处死，用眼科组织剪和组织镊完整剥离腋窝皮下肿瘤，用电子天平称量瘤重。

1.4.3 对脾脏指数的影响 各组小鼠于实验第14天称重。脱颈椎处死小鼠后，解剖取脾脏，用电子天平称重，计算脾脏指数，根据公式：脾脏指数脾脏重量/体重。

1.4.4 每日定时定量给予标准颗粒饲料，至次日收集剩余食量，称重并计算每日进食量，计算方法：每日给予量1次日剩余食量；每3天记录1次体重、肛温、腹泻、污秽情况、拉尾排便次数、拱背、毛色枯槁、嗜睡疲倦、乏力（悬空拉尾抵抗时间）等情况作为小鼠脾虚征象详情记录。

1.4.5 于实验的第14天秤重，眼眶球后取血1～2mL，静置2h，以3000r/min离心10min。取血清0.5～1mL，送检作胃泌素和D－木糖浓度测定。

1.4.6 血清胃泌素测定方法 采用放射免疫方法，（步骤操作按药盒说明）。

1.4.7 血清D－木糖浓度测定方法 采用间苯三酚法，（步骤操作按药盒说明）。

1.5 统计学方法

所有数据输入计算机，用SPSS 13.0统计软件分析处理。

统计描述：计量资料数据用均数±标准差（±s）表示。

统计推断：多组间均数的比较用方差分析；均以P

2 结 果

2.1 实验小鼠一般情况

2.1.1 各组小鼠一般状态 造模前，各组和小鼠精神良好，行动灵敏，毛色光泽，呼吸正常，饮食、饮水量正常，二便正常。实验第2天起，造模动物就开始出现稀便，污秽，神软萎靡，喜聚堆倦伏，毛色枯槁或散乱竖毛，拱背，活动缓慢，反应迟钝等动物脾虚证候。模型组从接种肿瘤第六天开始依次出现皮下结节，随着皮下结节的增大，出现行动迟缓，毛发缺乏光泽，饮食减少。

2.1.2 各组小鼠体重变化 小鼠造模前两组间体重无明显差异，两组小鼠从造模前到造模结束体重均有所增长，但造模组增长较为缓慢，造模结束后两组间有明显差异，模型组的小鼠体重明显小于对照组。各组动物体重改变如表1。

表1 各组小鼠平均体重变化情况（g，±s）

2.2 实验小鼠食量变化

脾虚造模各组于实验第2天起食量与正常组比较均有明显差异，造模组总体为为正常组的1/3，随着时间的推移，食量且持续较低。

2.3 实验小鼠肿瘤生长情况

实验第1～4天，造模小鼠右腋窝皮下均未触及肿瘤结节，自实验第5天始，小鼠出现皮下肿瘤结节。

2.4 胸腺指数 脾指数的测定

造模组胸腺指数较低，与正常对照组相比无明显统计学差异（P＝0.06），造模组脾脏指数较低，与正常对照组相比有明显统计学差异（P＝0.001）。如表2～3。

表2 实验动物胸腺指数的比较（±s，mg/g）

注：P＝0.06。

表3 实验动物脾脏指数比较（±s，mg/g）

注：P＝0.001。

2.5 血清胃泌素的测定

造模组小鼠的胃泌素低于模型对照组，有显著性差异（P＝0.003）。具体见表4。

表4 各组胃泌素与对照组比较（±s，pg/mL）

注：P＝0.003。

2.6 血清D－木糖醇浓度的测定

模型组-木糖醇水平较低，与对照组有明显差异（P＝0.001）。具体见表5。

表5 各组血清D-木糖醇水平与

对照组比较（mmol/L，±s）

注：P＝0.001。

3 讨 论

当前，中医或中西医结台的动物实验模型在研制及应用中大致有以下3种模式：一是以现代医学的病因病理为依据，复制出西医病名的动物模型，评价标准缺乏中医特色，评价指标特异性差；二是在中医理论指导下复制出以中医证侯名称为诊断的动物模型，但证通常包括多种病，证的层次越一般，包括的病种就越多。同属一证的多种疾病，其各自的病理机制企图由一动物模型的研究中得出来是不现实的；三是病证结合动物模型，病证结合动物模型指在中医药理论指导下，适当结合现代医学理论与实验动物科学知识，分别（或同时）采用传统中医学病因复制证候动物模型和采用现代医学病因复制疾病动物模型，使模型动物同时具有疾病与证候特征。由于该模型模拟了临床疾病与证候的病理对应关系，因此可作为研究载体进行临床病理研究与证候本质研究，更加广阔的应用前景是为中药新药客观疗效判定和药理作用探讨提供有效手段。

小鼠脾虚证诊断标准：参照文献【sup】［3］【/sup】根据小鼠本身的一些临床特点，结合人类脾虚证的诊断标准，确定以小鼠的食欲不振（食量减少）、消瘦（体重下降）、大便溏泻（拉尾排便次数增多，便形溏稀，污秽）、倦怠乏力（悬空拉尾抵抗力减弱）、毛发不荣、拱背、萎靡嗜睡、眯眼等症状、体征为主要诊断因素。选择几种比较公认的代表脾虚主要病理改变的客观指标作为辅助诊断指标：血清胃泌素、血清D-木糖浓度及胸腺指数、脾脏指数。

中医认为“有诸内者，必形之于外”，也就是说机体内部的变化往往能够在外部表现出来，即外部表现常常能在一定程度上反映机体内部的情况。因此，我们观察了小鼠的一般情况、体重、体力和进食量的变化等较直观的指标。造模小鼠从实验第2天起出现食少、部分出现稀便，污秽，扎堆，脱毛、体重减轻、活动缓慢、反应迟钝等症状，符合脾虚辨证标准。各症状均有从轻至重，至第六天最严重。从小鼠一般情况、食量、体重、耐力等指标观察，可见脾虚造模后小鼠出现明显脾虚症状。由于脾肾相因，肾中精气有赖于水谷精微的培育和补养，才能不断充盈和成熟，脾失健运则至肾精不足，肾之华在发，且发为血之余，脾虚则气血生化不足，苦寒泻下加劳倦过度作用于小鼠后，小鼠多数出现严重脱毛，亦可能与此有关，上述体重的变化是脾虚证侯的变化的反映。

胸腺是由胸腺基质细胞与胸腺细胞组成的。现在研究证实，脾与免疫功能之间存在许多相似之处。脾虚实验研究表明CD【sup】3+【/sup】T细胞、CD【sup】4+【/sup】T细胞、尤其是CD【sup】4+【/sup】/CD【sup】8+【/sup】比值下降，CD【sup】8+【/sup】T细胞比率升高，机体细胞免疫功能的下降，可反映脾虚免疫功能低下的本质【sup】［4］【/sup】。中枢和外周免疫器官在形态学上的退行性改变为脾虚证的病理学依据之一【sup】［5］【/sup】。本实验中发现，造模组脾脏指数较低，与正常对照组相比有明显统计学差异，与文献报道的小鼠长期脾虚造模的实验研究表明脾虚组动物脾脏指数呈降低趋势【sup】［6］【/sup】相符。造模组胸腺指数较低，与正常对照组相比无明显统计学差异。与文献报道略有偏差，我们考虑可能与实验操作中的误差有一定的关系。实验还发现造模组小鼠的胃泌素低于模型对照组，有显著性差异，说明胃泌素水平下降程度与脾虚证严重程度相应。模型组-木糖醇水平较低，与对照组有明显差异。正常小鼠造模后，血清D-木糖醇含量明显降低，伴随脾虚症状的出现，符合脾虚证诊断标准，说明小肠吸收功能的减弱是脾虚证的病理基础之一。这些客观指标的检测结果均可以证明该模型符合中医脾虚便秘证候的动物模型特点。

参考文献

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