姜黄素对CNE―2细胞放射敏感性及机制的影响

摘要： 目的：探讨姜黄素（Cur）对鼻咽癌细胞CNE-2放射敏感性及机制的影响。方法：克隆形成实验检测姜黄素对细胞放射敏感性的影响，Graph prism 6.0拟合细胞存活曲线；流式细胞术（FCM）分析细胞周期变化；基因芯片技术检测细胞长链非编码RNA表达差异，Real-time PCR验证部分差异表达基因。结果：10 μmol・L-1Cur作用24 h后，其放射增敏比1.03，表明低浓度的Cur可以增加鼻咽癌细胞的放射敏感性；FCM显示Cur联合照射组G2期细胞显著增加，S期细胞显著下降。GUCY2GP，H2BFXP，LINC00623等lncRNA 在姜黄素组细胞中显著上调，ZRANB2-AS2，LOC100506835，FLJ36000等lncRNA在姜黄素组细胞中显著下调。结论：Cur对人鼻咽癌细胞CNE-2具有放射增敏作用，其机制可能与改变细胞周期的分布和长链非编码RNA的表达有关。

关键词： 姜黄素；放射增敏；细胞周期；基因芯片；长链非编码RNA

[收稿日期] 2013-05-27

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81173616）；广东省科技计划项目（2013A03250003）；广州市海珠区科技计划项目（2013-cg-29）

[通信作者] *范钦，副研究员，Tel：13688859758，E-mail：

[作者简介] 王启瑞，讲师，博士，E-mail：

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我国南方地区的一种常见恶性肿瘤，占我国头颈部恶性肿瘤的首位，病因与遗传有一定关系。由于其特殊的病理类型、生物学行为和解剖结构，放射治疗（放疗）仍是首选的治疗方法。然而单纯放疗的鼻咽癌病人5年生存率约为50%，治疗失败的原因之一是鼻咽癌组织中存在一定比例（10%～20%）对放射线有抗拒作用的细胞，而且这些具有抗拒作用的细胞使肿瘤更具有侵袭性，容易发生淋巴结及远处转移[1]。因此研究其放射抗拒的机制、寻找放射增敏途径成为亟待解决的问题。研究发现姜黄素（curcumin，Cur）对多种恶性肿瘤有抑制作用[2-4]，并能增加肿瘤细胞对放射线照射的敏感性[5]。本研究拟探讨Cur对人鼻咽癌细胞CNE-2是否具有放射增敏作用，并研究其增敏机制，为寻找NPC的放射增敏剂提供理论依据。

1 材料

1.1 细胞培养 人低分化鼻咽癌CNE-2细胞株（中山大学肿瘤防治中心惠赠），培养于含有10%热灭活胎牛血清的RPMI-1640培养液中，37 ℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养。选取对数生长期细胞进行实验。

1.2 药品与试剂 姜黄素（中国食品药品检定研究院，批号110823-201004）；胰蛋白酶、RPMI-1640培养液（吉诺生物医药技术有限公司）；四季青胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；细胞周期检测试剂盒（碧云天生物技术研究所）；RNA 提取试剂、RT-PCR 试剂盒及所用酶（TaKaRa生物公司）；SBC Custom Human lncRNA 8*60K芯片由上海伯豪生物技术有限公司提供并检测。

1.3 仪器 二氧化碳培养箱（Thermo Scientific），超净工作台（苏净集团安泰公司），流式细胞仪（BD FACSCalibur，美国），直线加速器（varian.600C/D，美国）。

2 方法

2.1 克隆形成试验检测姜黄素联合照射对CNE-2细胞的放射增敏作用 将处于对数生长期细胞按照不同吸收剂量接种不同细胞数至6孔板中，分为姜黄素组和照射组，姜黄素组给予10 μmol・L-1的姜黄素作用24 h后，与照射组一起分别接受0，2，4，6，8 Gy 6 MV的X射线照射，继续培养2周，甲醇固定，吉姆萨液染色30 min，自然晾干后进行克隆计数。细胞数≥50个的集落被作为存活克隆予以计数。集落形成率（PE）=形成集落数/细胞接种数×100%；存活分数（SF）=实验组集落形成率/对照组集落形成率。

2.2 流式细胞术检测姜黄素联合照射对CNE-2细胞周期的影响 取对数生长期细胞，经0.25%胰酶消化，接种于6孔板中，分为空白对照组、姜黄素组（10 μmol・L-1）、照射组、姜黄素（10 μmol・L-1）+照射组。姜黄素预处理24 h后照射，照射后24 h收集细胞。收集的细胞以 PBS 洗涤，1 000 r・min-1离心4 min，2 次，加入含RNase A的PI染色液 0.5 mL，37 ℃避光染色30 min，上机检测。

2.3 基因芯片检测姜黄素对CNE-2细胞长链非编码RNA的影响 取对数生长期细胞， 接种于6孔板中，分为空白对照组、姜黄素（10 μmol・L-1）组。给予10 μmol・L-1的姜黄素作用24 h后，分别培养12～24 h，Trizol抽提细胞RNA，lncRNA芯片由上海伯豪生物科技有限公司提供并检测。将实验结果转换成数字型数据保存，使用配套软件对原始数据进行分析运算。Stratagene MX3005P荧光定量PCR仪检测Ct值并验证，基因名称和上、下游引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法，荧光定量PCR计算差异倍数的均值。

2.4 统计分析 应用SPSS 13.0进行分析，数据以±s表示，采用t检验进行组间比较，细胞周期结果比较采用单因素方差分析，P

3 结果

3.1 姜黄素对CNE-2细胞放射敏感性的影响 采用GraphPad Prism 6.0软件按单击-多靶模型和线性-二次模型[6]分别拟合细胞存活曲线，求出相应的数学模型参数D0，Dq，N和α，β，α/β值，并计算放射增敏比（SER）。SER=对照组D0/药物处理组D0。结果显示姜黄素对鼻咽癌CNE-2 细胞具有放射增敏效应，见图1及表2。

图1 按单击-多靶模型（上）和线性-二次模型（下）拟合的细胞存活曲线

Fig.1 Fitting cell survival curve by GraphPad Prism 6.0

3.2 流式细胞仪检测姜黄素对细胞周期的影响 CNE-2细胞经4 Gy照射后，G1期及S期细胞比例显著减少，G2期细胞比例显著增加；经姜黄素作用24 h后，G1期细胞比例显著减少，G2细胞比例仪轻微增加，S期细胞比例显著增加；当姜黄素与4 Gy联合应用时，G2期细胞比例显著增加，S期细胞比例显著减少，见表3。

3.3 姜黄素对CNE-2细胞LncRNA表达的影响

GUCY2GP，H2BFXP，LINC00623等lncRNA 在姜黄素组细胞中显著上调，ZRANB2-AS2，LOC100506835，FLJ36000等lncRNA显著下调（无统计学意义的lncRNA表中未列出）。所有实验采取3次独立重复，表达差异倍数及统计分析见表4。

4 讨论

本研究分别采用单击-多靶模型和线性-二次模型拟合细胞存活曲线。在单击-多靶模型中，参数D0为平均致死剂量，D0值越大，细胞对射线越抗拒；Dq为拟阈剂量，反映细胞对亚致死性损伤的修复能力，Dq值越小，亚致死性损伤的修复能力越弱。在线性-二次模型中，α值的意义与Dq雷同，其值愈小细胞对亚致死性损伤的修复能力愈强；β值的意义与D0雷同，其值愈大细胞对放射愈抗拒，α/β比值较大的细胞修复能力较弱， 放射敏感性较高；α/β比值较小的细胞修复能力强， 放射敏感性较低[6]。在本实验中，CNE-2细胞照射组的α/β值为9.235 0，姜黄素+照射组α/β值为981.305 0（P

细胞周期中不同时相的细胞放射敏感性有很大差别，G2后期和M期放射敏感性最高，G1/S边界细胞次之，S后期及G1早期细胞具有很强的放射抵抗性[7]。促使肿瘤G1/S期细胞进入并停留在G2/M期，是提高肿瘤放射敏感性的一个重要途径[8]。在本研究中与对照组相比，药物+放射组G2期细胞比倒显著增多（P

lncRNA是一类转录本长度在200 nt～100 kb的一类非编码RNA分子，位于细胞核内或胞浆内，在真核细胞内被普遍转录，但不具有或很少具有蛋白编码功能。目前研究证实lncRNA的异常表达与多种恶性肿瘤的发生发展相关[9]。芯片结果显示，给予姜黄素处理后大量lncRNA表达差异显著，提示姜黄素可影响lncRNA的表达。荧光定量PCR验证了部分结果的可靠性，其中ZRANB2-AS2表达显著下调，最近的研究表明ZRANB2基因产物为一类锌指蛋白，它通过结合Smad蛋白而抑制BMP信号通路[10]。ZRANB2-AS2为ZRANB2基因的部分反义序列，ZRANB2-AS2的低表达可能使ZRANB2激活，从而抑制了BMP表达，进而使肿瘤细胞生长抑制或凋亡[11]。本研究证实姜黄索对人鼻咽癌CNE-2细胞具有放射增敬作用。其作用机制可能与改变CNE-2细胞周期分布和lncRNA的表达有关。

[参考文献]

[1] Tham I W， Hee S W， Yap S P， et al. Retropharyngeal nodal metastasis related to higher rate of distant metastasis in patients with N0 and N1 nasopharyngeal cancer[J]. Head Neck，2009，31（4）：468.

[2] Gupta S C， Patchva S， Koh W， et al.Discovery of curcumin.A component of golden spice， and its miraculous biologicalactivities[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2012，39（3）：283.

[3] Anand P， Sundaram C， Jhurani S， et al.Curcumin and cancer： an "old-age" disease with an "age-old" solution [J].Cancer Lett， 2008， 267（1）：133.

[4] 郭立达，焦振霞，宋瑛，等. 姜黄素诱导结肠癌LoVo细胞凋亡的作用及机制研究[J]. 中国中药杂志，2013，38（13）：2191.

[5] Khafif A， Lev-Ari S， Vexler A， et al. Curcumin： a potential radio-enhancer in head and neck cancer[J]. Laryngoscope，2009，19（10）：2019.

[6] 沈瑜，糜福顺. 肿瘤放射生物学[M].北京：中国医药科技出版社，2002：62.

[7] Liu Y， Cooper P R，Barralet J E， et al. Influence of calcium phosphate crystal assemblies on the proliferation and osteogenic gene expression of rat bone marrow stromal cells[J]. Biomaterials，2007，28（7）：1393.

[8] Ahmad M， Gawronski D， Blum J，et al.Differential response of human osteoblast――like cells to commercially pure（cp） titanium grades 1 and 4[J].J Biomed Mater Res，1999，46（1）：121.

[9] Gutschner T， Diederichs S. The hallmarks of cancer： a long non-coding RNA point of view[J]. RNA Biol， 2012，9：703.

[10] Ohte S， Kokabu S， Iemura S， et al. Identification and functional analysis of Zranb2 as a novel Smad-binding protein that suppresses BMP signaling[J]. J Cell Biochem， 2012，113（3）：808.

[11] 叶明福.骨形态发生蛋白-2与上皮性肿瘤间的关系[J].国际口腔医学杂志，2009， 36（1）：102.

Effect of curcumin on radiosensitization of CNE-2 cells and its mechanism

WANG Qi-rui1， FAN Hao-ning1， YIN Zhi-xin2， CAI Hong-bing1， SHAO Meng1， DIAO Jian-xin1，

LIU Yuan-liang1， SUN Xue-gang1， TONG Li1， FAN Qin1*

（1. College of Traditional Chinese Medicine， Southern Medical University， Guangzhou 510515， China；

2. Gene Research Institute， Southern Medical University， Guangzhou 510515， China）

[Abstract] Objective： To investigate the effect of curcumin （Cur） on radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cell CNE-2 and its mechanism. Method： The effect of curcumin on radiosensitivity was determined by the clone formation assay. The cell survival curve was fitted by Graph prism 6.0. The changes in cell cycle were analyzed by flow cytometry （FCM）. The differential expression of long non-coding RNA was detected by gene chip technology. Part of differentially expressed genes was verified by Real-time PCR. Result： After 10 μmol・L-1 Cur had worked for 24 h， its sensitization enhancement ratio was 1.03， indicating that low concentration of curcumin could increase the radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cells； FCM displayed a significant increase of G2 phase cells and significant decrease of S phase cells in the Cur combined radiation group. In the Cur group， the GUCY2GP， H2BFXP， LINC00623 lncRNA were significantly up-regulated and ZRANB2-AS2 LOC100506835， FLJ36000 lncRNA were significantly down-regulated. Conclusion： Cur has radiosensitizing effect on human nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells. Its mechanism may be related to the changes in the cell cycle distribution and the expression of long non-coding lncRNA.

[Key words] curcumin； radiosensitization； cell cycle； gene chip； long non-coding RNA （lncRNA）

doi：10.4268/cjcmm20140328