用HPLC法测定蒙药阿嘎日-10中羟基红花黄色素A的含量

[摘 要] 目的是应用反相HPLC法，建立阿嘎日－10含量测定方法。本制剂中羟基红花黄色素A在0.0168～0.0.168mg/ml浓度范围内面积与浓度呈良好的线性关系（r=0.9997）；加样回收率为98.20%，RSD为0.50%（n=6）。证实了该方法具有简便、准确、灵敏度高等特点，可作为本品的质控方法。

[关键词] 反相高效液相色谱法；阿嘎日－10；羟基红花黄色素A；含量

阿嘎日－10由沉香、诃子、甘草、沙棘、人工牛黄、红花、木鳖子、瞿麦、五灵脂、紫花地丁等十味药组成。其中红花具通经散瘀，消肿止痛的功能。参照《中国药典》2005年版一部中“红花”项下的含量测定方法，对处方中红花所含的羟基红花黄色素A进行测定，通过试验分析，结果表明该方法重现性好，专属性强，方中其它组分对羟基红花黄色素A的测定无干扰，本方法可作为该药品的质控方法。

1.仪器与试药

1.1仪器

岛津LC-2010A HT高效液相色谱仪 SCL-10ATvp型控制器，SPD-10Avp型检测器，LCsolution色谱工作站。UA-1700型紫外－可见分光光度计。Sartorius Bp121S（0.1mg） Bp211D（0.01mg）电子天平。

1.2试剂与试药

羟基红花黄色素A对照品（批号：111637-200503供含量测定用）：由中国药品生物制品检定所提供；样品：阿嘎日-10由呼伦贝尔市新巴尔虎左旗蒙医院提供。甲醇为色谱纯，乙腈为色谱纯，水为高纯水，其他试剂均为分析纯。

2.方法与结果

2.1色谱条件

十八烷基建和硅胶为填充剂；流动相：甲醇-乙腈-0.7%磷酸（26：2：72）（用三乙胺调pH至6.0±0.1）；柱温：30℃；检测波长：403nm；进样量：10μl。

2.2提取条件的选择

参照中国药典2005版一部“红花”项下对羟基红花黄色素A的提取方法，以25%甲醇作为提取溶剂进行超声提取，为保证被测成分的完全提取，实验中考察了超声20分钟、30分钟、40分钟、50分钟不同提取时间对提取效率的影响，含量测定结果见表1。

从表中数据可见，超声40分钟供试品中羟基红花黄色素A的含量基本稳定不变，故将提取时间定为超声40分钟。

2.3试验溶液的制备

对照品溶液的制备 取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加25%甲醇制成每1ml含33.6μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备 取本品约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇50ml，称定重量，超声40分钟，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液的制备 精密称取按处方比例并以相同工艺制备的缺红花的样品2.5g按供试品溶液制备法制得阴性对照溶液。在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测得结果为：阴性对照色谱图中在与羟基红花黄色素A对照品以及供试品色谱图相应的保留时间处无色谱峰出现，表明其他组分对羟基红花黄色素A的测定无干扰。

羟基红花黄色素A、阴性对照溶液、供试品溶液色谱图见图1

羟基红花黄色素A色谱图

阴性对照溶液色谱图

供试品溶液色谱

2.4线性关系试验

取羟基红花黄色素A对照品（批号110715-200413）约4.2mg，精密称定，置25ml量瓶中，加25%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀（0.168mg/ml），精密吸取0.5、1、2、3、4、5、ml，分别置10ml量瓶中，加25%甲醇稀释至刻度，摇匀，各取10μl进样，按上述色谱条件测定，以峰面积对对照品进入的量进行回归分析，结果羟基红花黄色素A在0.00112μg～0.0112μg范围内呈良好的线性关系。回归方程为y=259533x+14571，r=0.9997。标准曲线数值见表2。

2.5稳定性试验

取样品含量测定项下制备的供试品溶液1份，分别于0小时、2小时、4小时、8、12、24小时进行测定，结果见表3。

从表中数据可以看出，羟基红花黄色素A在12小时内的峰面积积分值基本稳定

2.6精密度试验

取同一批号（20090802）供试品6份，各约2.5g，精密称定，分别按样品含量测定项下方法操作，测定每份供试品的含量，结果平均值为0.7463mg/g，RSD%为0.24%。结果见表4。

2.7加样回收试验

取已知羟基红花黄色素A含量（含量为0.7463mg/g）供试品6份，每份约1.25g，精密称定，分别置6个具塞锥形瓶中，精密加入用25%甲醇配制的羟基红花黄色素A对照品溶液（羟基红花黄色素A浓度0.932mg/ml）1ml，再精密加入49ml25%甲醇制成供试品溶液，按样品含量测定项下的方法操作，测定每份的含量，计算回收率，结果平均回收率为98.20%，RSD%为0.50%结果见表5。

2.8样品的含量测定

取本品3个批号共6份，各约2.5g，按供试品溶液的制备方法处理，分别精密吸取供试品溶液与对照溶液各10µl注入液相色谱仪，按外标法计算含量。三批样品的测定结果见表7。

3.讨论

3.1检测波长的选择

精密称取羟基红花黄色素A对照品适量，用25%的甲醇制成每1ml含15μg的溶液，于紫外－可见分光光度仪上，在190nm～600nm波长范围扫描，结果羟基红花黄色素A在波长403nm、223nm处有最大吸收。参照中国药典2005版一部“红花”含量测定项下羟基红花黄色素A的测定方法，选择403nm作为检测波长。

3.2本实验精密度及回收率试验结果表明，该方法具有较好的准确度和重现性，可作为该制剂的含量测定方法。

参考文献：

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典[M].北京：化学工业出版社，2005.