养阴活血方药对糖尿病大鼠肝脏线粒体琥珀酸脱氢酶和三磷酸腺苷酶的影响

[摘要] 目的 探讨养阴活血方药对糖尿病大鼠肝脏线粒体琥珀酸脱氢酶（SDH）和三磷酸腺苷酶（ATP酶）活性的影响。 方法 选取SD大鼠24只，随机分为三组：正常对照组，糖尿病模型组，中药干预组。除正常对照组外，其他两组腹腔注射链脲佐菌素（STZ）造糖尿病模型。正常对照组和糖尿病模型组自由饮水，中药干预组按人与动物间体表面积折算的等效剂量比值灌喂给药。造模成功后10周，股动脉放血，并取肝脏，提取大鼠肝脏线粒体，并测定SDH和ATP酶活性的变化，观察肝细胞线粒体超微结构。 结果 与正常对照组[（3.91±0.43）U/mgprot]比较，糖尿病模型组大鼠肝脏线粒体SDH[（2.31±0.27）U/mgprot]活性显著降低（P < 0.01），Na+-K+-ATP酶[（0.57±0.18）U/mgprot]活性显著低于对照组[（2.39±0.28）U/mgprot]（P < 0.01），Ca2+-Mg2+-ATP酶[（0.95±0.19）U/mgprot]活性显著低于对照组[（2.18±0.09）U/mgprot]（P < 0.01），肝组织透射电镜观察：肝细胞线粒体空泡化，线粒体嵴、膜大部分融合、消失，粗面内质网脱颗粒现象明显。与糖尿病模型组相比，中药干预组SDH[（3.39±0.29）U/mgprot]、Na+-K+-ATP酶[（1.70±0.22）U/mgprot]和Ca2+-Mg2+-ATP[（1.75±0.09）U/mgprot]酶活性均有显著升高（P < 0.01），肝组织透射电镜观察：细胞线粒体无空泡，损伤程度轻。 结论 养阴活血方药可有效提高大鼠肝脏线粒体SDH活性、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，这可能是养阴活血方药对糖尿病大鼠肝脏线粒体保护作用机制之一。

[关键词] 糖尿病；肝脏；线粒体；琥珀酸脱氢酶；三磷酸腺苷酶；养阴活血方药

[中图分类号] R587.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）09（b）-0016-03

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是严重威胁人类健康的常见内分泌代谢疾病，肝脏作为长期受高血糖刺激的脏器之一，肝脏与糖尿病的关系逐渐受到人们重视。糖尿病肝病是糖尿病的一种慢性并发症，其病因及发病机制仍未完全明了。糖尿病属祖国医学消渴证，阴虚为本[1]。养阴活血方药是经多年研究和临床试验的核心方剂[2]。琥珀酸脱氢酶（SDH）是线粒体内膜的结合酶，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，可为线粒体需氧和产能的呼吸链提供电子，是反映线粒体功能的标志酶之一[3]。三磷酸腺苷酶（ATP酶）是维持胞内离子内环境稳定和神经元兴奋性、冲动传导、突触传递的重要物质基础，为葡萄糖和氨基酸的摄取提供驱动力，维持细胞生命活动，也是反映线粒体功能的重要酶之一[3-4]。本研究在线粒体水平研究糖尿病大鼠肝脏的损伤作用，并且观察糖尿病大鼠肝脏线粒体中ATP酶和SDH活性的变化。同时采用养阴活血方药对糖尿病大鼠进行治疗，研究其对糖尿病肝病的防治作用，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用清洁级健康雄性SD大鼠，体重为250～300 g，24只，由河北省实验动物中心提供（动物合格证编号：809091）。

1.2 中药配方

养阴活血方药组成：熟地20 g、牡丹皮20 g、山药15 g、山茱萸10 g等。

1.3 主要仪器及试剂

血糖检测仪（购于强生公司），3K-15型高速冷冻离心机（Sigma公司），7200型可见分光光度计（上海尤尼柯公司），链脲佐菌素（STZ，Sigma公司），线粒体提取试剂盒（批号20090809）、ATP酶测定试剂盒（批号20090710）、SDH测定试剂盒（批号20090710）均购自南京建成生物工程研究所，其余试剂均为国产分析纯。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 4月龄健康雄性SD大鼠24只，适应性喂养1周后，随机分为三组：正常对照组（8只）；糖尿病模型组（8只）；中药干预组（8只）。

1.4.2 糖尿病动物模型制备及给药 除正常对照组外，其他两组腹腔注射STZ造糖尿病模型。各组正常饲料喂养，正常对照组和糖尿病模型组自由饮水，中药干预组按人与动物间体表面积折算的等效剂量比值灌喂给药。

1.4.3 取材 造模成功后10周，对各组大鼠进行称重，股动脉放血，并取肝脏，部分进行固定，其余立即放入液氮，-70℃保存备用。

1.4.4 ATP酶和SDH活性的测定 取一小块肝组织，称重，用匀浆介质制成10%组织匀浆，提取线粒体，然后测SDH活性、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.5 肝线粒体超微结构的观察 取肝组织切成1 mm×1 mm×1 mm的小块，用4%戊二醛进行固定，磷酸缓冲液浸洗3次，每次10 min，然后用锇酸（10 g/L）固定2 h，环氧树脂包埋，切片，染色，然后在电镜下进行观察。

1.5 统计学方法

用SPSS 17.0软件进行统计学处理分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肝线粒体ATP酶和SDH活性测定结果

与正常对照组比较，糖尿病模型组的SDH活性明显降低，Na+-K+-ATP酶与Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明显降低（P < 0.01）。见表1。与糖尿病模型组相比，中药干预组SDH活性、Na+-K+-ATP酶与Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均有显著升高（P < 0.01）。见表2。

表1 大鼠肝线粒体琥珀酸脱氢酶和三磷酸腺苷酶活性

（糖尿病模型组与正常对照组）（U/mgprot，x±s）

注：与正常对照组比较，*P < 0.01；SDH：琥珀酸脱氢酶；ATP酶：三磷酸腺苷酶

表2 大鼠肝线粒体琥珀酸脱氢酶和三磷酸腺苷酶活性

（中药干预组与糖尿病模型组）（U/mgprot，x±s）

注：与糖尿病模型组比较，*P < 0.01；SDH：琥珀酸脱氢酶；ATP酶：三磷酸腺苷酶

2.2 肝线粒体超微结构变化

通过观察透射电镜下（×15 000）肝组织，与正常对照组比较，糖尿病模型组可见肝细胞线粒体空泡化，线粒体嵴大部分融合、消失，线粒体膜部分融合、消失；粗面内质网轻度扩张，脱颗粒现象明显。中药干预组肝细胞线粒体无空泡，但是线粒体嵴和膜不清晰。而正常对照组肝细胞线粒体完整，线粒体嵴清晰。见图1。

A：正常对照组；B：糖尿病模型组；C：中药干预组

图1 养阴活血方药对大鼠肝脏线粒体超微结构的影响（TEM，×15 000）

3 讨论

糖尿病是一种新陈代谢疾病，以慢性高血糖为特征，因胰岛素分泌、胰岛素活性异常所致；糖尿病患者经常伴有高脂血症，心血管病病死率高[6]。据世界卫生组织报道，2011年全球有近三亿六千四百万人罹患糖尿病。2004年全世界有340万人因高血糖致死[7]。

肝脏是能量代谢的重要器官，含有丰富的线粒体，而线粒体是真核细胞中重要的细胞器，是细胞有氧呼吸的基地和能量供应的场所，细胞生命活动大约95%的能量来自线粒体[8]；线粒体的一个重要生物学功能是氧化代谢和钙代谢，其正常运行依赖于结构的完整性。线粒体的氧化磷酸化功能与钙平衡状态密切相关。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶对调节线粒体膜内外的离子平衡至关重要，其活性依赖于膜流动性并受ATP水平的影响[9]。细胞内Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性下降，必然会导致细胞内Na+超载，进而引起线粒体中的Ca2+释放和细胞内Ca2+超载；Mg2+-ATP酶活性下降则导致细胞内Mg2+减少，削弱Mg2+-ATP酶对Ca2+超载的生理拮抗作用，抑制蛋白质和能量合成，降低多种酶的活性，增加细胞膜的通透性，造成了离子分布状态失衡和水积聚，线粒体结构破坏，最终导致组织细胞损伤和死亡。高血糖和血脂成分的变化造成膜酶的糖化，致使Na+-K+-ATP酶活性降低[10]，也会致线粒体结构破坏，组织细胞凋亡。

SDH是嵌在线粒体内膜上的一种多聚体酶，具有双重作用；一是三羧酸循环的关键性脱氢酶，二是氧化磷酸化以及把电子直接传递给辅酶Q10的呼吸链的重要组分。SDH氧化琥珀酸形成三羧酸循环组分之一的延胡索酸，其氧化辅酶Q10形成线粒体电子传递链里的泛醇[11]。SDH活性的变化可反映细胞能量代谢情况和三羧酸循环状态[12]，该酶活性的升高表明线粒体经由短呼吸链中ATP产生的增加以及三羧酸循环的加快[13]；SDH活性增强时，琥珀酸受体的表达下降；而SDH活性逐渐降低时，琥珀酸受体表达则随之显著升高[14]。SDH是检测线粒体损伤程度的敏感指标[15]。

实验结果表明，与正常对照组比较，糖尿病模型组的钠钾ATP酶与钙镁ATP酶活性明显降低，SDH活性明显降低，观察线粒体超微结构，模型组可见肝细胞线粒体空泡化，线粒体嵴大部分融合、消失，线粒体膜部分融合、消失；粗面内质网轻度扩张，脱颗粒现象明显。这说明糖尿病使肝脏中线粒体损伤程度严重，表明糖尿病对肝脏会造成功能性损伤。

经过10周的饲养，模型组大鼠肝脏线粒体SDH及ATP酶活力均有大幅降低，说明长期糖尿病可引起肝脏线粒体功能衰减，有可能引起肝组织线粒体钠-钾泵、钙-镁泵及呼吸链功能障碍，从而引起糖尿病肝病。有资料显示，中药可以治疗糖尿病并发症[16]。研究结果表明，与糖尿病模型组相比，中药干预组SDH活性、钠钾ATP酶和钙镁ATP酶活性均有显著升高，观察线粒体超微结构，肝细胞线粒体无空泡，损伤程度较轻，说明此配方中药对糖尿病患者的肝脏线粒体损伤有明显的防治作用。

糖尿病属于中医学中“消渴病”范畴，病因多为阴伤所致，本实验所用养阴活血方药由熟地、牡丹皮、山药、山茱萸等中药组成。其中熟地可滋阴补血，山萸肉可滋补肝肾，诸药并用以奏养阴活血之功。研究结果表明，养阴活血方药可有效提高SDH和ATP酶活性，这可能是养阴活血方药对糖尿病大鼠肝脏线粒体的保护作用机制之一。

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（收稿日期：2013-02-18 本文编辑：张瑜杰）