时间：2022-09-25 06:38:36
【摘要】目的：探讨一种建立兔急性心肌梗死(MI)模型的简易方法。方法：健康成年雌兔20只，在无气管插管和呼吸机的情况下，正中纵行剪开下段胸骨，同时保持肋骨和胸膜腔完整，在左心耳缘下5~10 mm内缝扎左室支(LVB)，建立MI模型，结扎LVB 30 min后查心电图(ECG)。4周后，行ECG、心脏彩超检查。符合MI心脏彩超和ECG造模成功标准的兔，视为造模成功；并制作心肌病理切片，行HE染色、Masson三色染色，观察病理变化。结果：结扎LVB后，兔ECG出现心肌缺血改变；术后4周动物存活率85%，造模成功率70%，左室舒张末内径(LVEDD)、左室收缩末内径(LVESD)、左室缩短分数(LVFS)与术前差异均有统计学意义(P
【关键词】心肌梗死；兔动物模型；左室支
A Simple Rabbit Model of Myocardial Infarction/YANG Yong-hui，LI Tong，ZHAO Yue，et al.//Medical Innovation of China，2012，9(10)：001-003
【Abstract】Objective：To prepare a simple，reliable rabbit myocardial infarction model.Methods：Carefully incising the lower sternums of 20 healthyfemale rabbits along the midline，without endotracheal intubation and ventilator，maintaining the integrity of the ribs and pleural cavity，and ligated left ventricular branch at 5~10 mm below the left atrial appendage，to establish the model of myocardial infarction.4 weeks later，the survival rabbits were detected by the ECG and echocardiography.Rabbits which complied with the model standard of the ECG and echocardiography were considered as successful MI models.Made some myocardial pathological biopsy，stained with HE and Masson trichrome，then，observing pathological changes.Results：14 rabbits had myocardial ischemia changes in ECGand decreased cardiac function in echocardiography 4 weeks after ligation of LVB.The survival rate and success rate of model rabbits were 85% and 70% after postoperative 4 weeks respectively.The statistically significant differences were found in the left ventricular end-diastolic diameter，left ventricular end-systolic diameter，and left ventricular fractional shortening，compared with preoperative(P
【Key words】Myocardial infarction;Rabbit animal model;Left ventricular branch
First-author’s address：Graduate School of Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2012.10.001
动物心肌梗死(myocardial infarction，MI)模型是研究MI病理生理机制和探索新型治疗途径的基本环节。虽然猪、狗等大型动物MI模型有很多优点，但是对操作技能要求高，死亡率高，且购买、饲养等成本高[1]，难以开展大规模的实验，限制其在科研中的应用。兔心冠状动脉的侧支循环少(与人相似)，而且阻断后发生致命的心律失常及死亡率低[2-3]。本研究根据兔胸腔的解剖特征，参照Fujita法[4]，并加以改良，在无气管插管、人工通气供氧的情况下建立MI实验动物模型，观察其心电图(electrocardiogram，ECG)、心脏彩超的变化及心肌组织学特征，探索这种模型制作的可行性。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物健康成年雌性日本大耳白兔20只，兔龄5个月左右，体质量2.0~2.5 kg，由天津市津南区春乐实验动物养殖场提供，动物合格证号为SCXK示2009-0004，实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。
1.1.2主要试剂、仪器及手术器械盐酸氯胺酮注射液(福建古田药业有限公司)，戊巴比妥钠(天津市联星生物技术有限公司)，盐酸利多卡因注射液(天津金耀氨基酸有限公司)，注射用青霉素(哈药集团制药总厂)；光电6511单道心电图机，PHILIPS IE33心脏彩色多普勒超声仪，探头S5-1；深部拉钩、带线缝合针、剪刀。
1.2心肌梗死模型制备参照 Fujita 法[4]。氯胺酮25 mg/kg经肌肉注射，同时1%戊巴比妥钠1 ml/kg经腹腔注射，保持兔自然呼吸状态，仰卧位将兔固定于动物手术板上，心电图机肢体导联线与兔四肢相连接，记录Ⅱ导联ECG。剪除胸前区毛，碘伏消毒，铺无菌巾，切口用1%利多卡因1 ml局麻，并预防心室颤动的发生。沿胸部中线纵切开皮肤、皮下组织、肌肉，正中纵行剪开下段胸骨3 cm，用拉钩轻轻拉开胸骨，避免损伤胸膜和胸廓内血管，用眼科剪纵行剪开心包，暴露心脏，拉开两侧心包及胸骨，可清楚看到左前降支(left anterior descending，LAD)的伴行静脉及左心耳，轻轻牵拉左心耳右移，可见左室支(left ventricular branch，LVB)的伴行静脉，用6-0外科 Prolene线于LVB距离左心耳缘下5~10 mm内[3，5]“8”字缝扎LVB，结扎远侧颜色变暗或发白，搏动减弱，ECG示ST段上抬，表明缝扎完全，初步判断模型制作成功， 温生理盐水清洗心包腔，心包不缝，逐层关胸，缝合切口。整个手术过程约30 min。如术中损伤胸膜引起气胸，应尽快完成手术，关闭胸腔后用注射器胸腔穿刺抽气，恢复胸腔内负压。术后连续3 d肌注青霉素40万U，1次/d。
1.3模型监测及评价
1.3.1ECG监测实验兔四肢及胸前连接电极，分别于冠状动脉结扎前、结扎后30 min、建模后4周行ECG检查，记录Ⅱ导联。冠状动脉结扎后30 min较结扎前出现典型ST段弓背抬高，T波高耸；同时建模后4周出现病理性Q波作为建模成功的标准之一。
1.3.2心脏彩超检查实验兔于造模前及造模后4周行心脏彩超检查，测定心率(heart rate，HR)，左室舒张末内径(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)，左室收缩末内径(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)，左室缩短分数(left ventricular fractional shortening，LVFS)。为减小检查造成的误差，所有检查均由同一位医师在同一台机器上进行。各检测指标以系统默认方法计算，以术后LVFS≤35%作为建模成功标准之一[6]。
1.3.3病理组织学检查造模后4周(做完ECG和心脏彩超后)处死动物，取出心脏，观察大体形态。标本置于10%福尔马林中固定，石蜡包埋，沿心脏长轴中点横切取材，切片4 μm厚，HE染色，光镜下观察病理组织学改变。Masson三色染色，光镜下观察梗死区与正常供血区心肌染色。
1.4统计学处理采用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料以(x±s)表示，统计学分析采用配对设计资料的t检验，以P
2结果
2.1建模存活率术中1只兔发生麻醉意外死亡，1只发生心室颤动死亡；术后2只发生伤口感染，经清创抗感染后治愈；术后1只发生呼吸道感染，医治无效，术后3周死于心肺衰竭。建模后4周共存活17只兔，存活率为85%(17/20)。
2.2ECG的演变建模后4周存活的17只兔中：17只冠脉结扎前ECG正常(图1)，17只冠脉结扎后30 min ECGⅡ导联ST段均呈弓背抬高，T波高耸(图2)；16只术后4周ECG Ⅱ导联出现病理性Q波(图3)，1只未出现病理性Q波。16只符合ECG建模成功的标准。
图1术前ECG图2术后30 min ECG
图3术后4周ECG
2.3心脏彩超实验兔术前均LVFS≥38%。术后4周存活的17只兔：14只LVFS≤35%，其中5只提示室壁瘤，2只提示心脏周围积液，14只提示心室壁运动减弱，均表明动物心功能下降；另外3只术后LVFS分别为37%、38%、39%。同时符合ECG和心脏彩超建模成功标准的兔14只(表1)，造模成功率70%(14/20)。
表1建模前后心脏彩超结果(x±s)
时间 HR(次/min) LVFS(%) LVEDD(mm) LVESD(mm)
建模前 218.93±44.14 41.79±2.85 11.00±1.05 8.58±0.72
建模后 199.86±34.72 31.43±3.50 12.55±1.69 9.98±1.45
注：HR：心率；LVFS：左室缩短分数；LVEDD：左室舒张末内径；LVESD：左室收缩末内径。与建模前相比，P
2.4病理检查建模成功的14只兔心脏，肉眼观局部粘连较多，梗死瘢痕区明显变薄，呈灰白色，形状不规则，主要在左室前侧壁及心尖部，5例有室壁瘤形成；HE染色显示：梗死区心肌细胞排列紊乱，可现空泡变性，核溶解消失；Masson三色染色显示：梗死区心肌呈蓝色染色，见图4。
图4正常心肌与梗死心肌组织病理结果(×200)
注：A：正常心肌组织HE染色；B：梗死心肌组织HE染色；C：正常心肌组织Masson32三色染色；D：梗死心肌组织Masson三色染色
3讨论
兔子心脏解剖结构以及冠状动脉的分支、走行、侧支循环与人类相似，冠状动脉阻断后死亡率低[2-3]，而且兔子大小、价格适中，容易操作和饲养，因此，兔子是制作MI模型较常用的动物。
开胸结扎冠状动脉是制作MI模型较常用的方法。传统MI动物模型制作需气管插管和呼吸机辅助呼吸：有的经左侧第4肋间隙[3]切断肋间肌入胸，该术式虽然简单，极易损伤胸廓内血管；有的经胸骨左缘胸肋关节处剪断Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ肋骨开胸[7]，该术式易损伤胸廓内血管致胸腔积血，不仅影响手术视野的清晰暴露，而且常常因大量失血发生各种并发症；肋骨断端若对位不良，改变胸腔结构，损伤心肺，不利于所需指标的检测和术后恢复，影响实验效果。兔口腔解剖复杂(门切牙长，嘴小，喉部狭窄)，气管插管困难，易损伤呼吸道；应用小动物呼吸机不仅操作繁琐，还易产生呼吸机应用相关性肺损伤，均影响动物术后的恢复及建模成功的效果。而家兔的双侧胸腔互不相通，胸骨后两侧的壁胸膜相互分离，当沿胸骨中线或左缘开胸和打开心包胸膜，暴露心脏时，只要不损伤纵膈膜，就不需要机械通气[8]：从剑突处开始剪开胸骨直至颈静脉切迹[4，9]，这种术式对心脏显露充分，但手术创伤太大。本实验无气管插管和呼吸机辅助，在动物自然呼吸空气下纵断下段胸骨3 cm(胸骨全长约6 cm)，心脏显露良好，不损伤肋骨、肋间肌肉、肋间血管和胸膜，手术创伤小，出血少，有1例胸腔基本无出血，开胸取心脏时未见明显粘连；不需气管插管、动物呼吸机、人工供氧，对设备要求低。
兔冠状动脉除主干外均走行于心肌内，直视下不能看见，但常有伴行静脉走行于心脏表面。因此，研究者常常凭借伴行静脉进行冠状动脉结扎，制作MI模型。兔LAD是制作MI模型最常用的靶血管，主要原因是LAD走行于前室间沟，易暴露，易操作。但兔的LAD个体差异较大，长短不一，多终止于前室间沟上1/3，部分可达心尖，甚至13%~14%无LAD[10-11]，供血范围差别太大，成模率不稳定。而LVB发自于左旋支主干，相当于人类心脏左缘支，粗大行程长，直达心尖或绕过心尖与右冠状动脉吻合，供应左心大部[10-12]。本实验2/20只兔无LAD，其中10/20只兔LAD长度大于前室间沟长度的1/3，20/20只兔LVB粗大恒定，故LVB是制作MI模型的理想靶血管。但LVB及伴行静脉位于心脏左缘，打开心包后不能直接发现，需要抬高心尖、右移心脏等，笔者认为牵拉左心耳最简单：轻轻钳夹并向右牵拉左心耳，缝扎LVB，仅需几秒钟。因此通过结扎兔LVB制作MI模型。如果结扎位置过高，所结扎的冠状动脉血管较粗，肉眼易分辨，易结扎，结扎效果明显，但有相当高的恶性心律失常和死亡率；而结扎位置过低，所结扎冠状动脉较细，肉眼难分辨，手术操作难度加大，结扎后梗死面积太小而无明显效果，但能降低动物恶性心律失常率和死亡率。本实验中1例因结扎位置过高(左心耳下缘)，诱发室颤死亡。LVB结扎部位应在左心耳缘下5~10 mm 内[3，5]。
如果建模成功后还需要后续治疗，就不能以心肌病理切片作为建模成功的标准。以往研究多采用ECG动态变化作为建模成功的标准，杨国勋等[13]制作兔MI模型后，存活的10只兔，术前ECG正常，术后10 min内ECG显示ST段明显抬高(>0.2 mV)，术后6周出现病理性Q波，但病理显示3只兔镜下仅见较小的心内膜下MI以及不连续的MI，有2只兔未见MI。所以仅以ECG动态变化作为建模成功的标准不可靠。多次取血动态检测心肌酶的变化是临床上诊断急性MI常用的方法，但兔耳缘静脉细，兔静脉血采集困难，而且心肌酶的升高受肌肉损伤程度、心肌梗死范围等的影响。冠状动脉造影是诊断MI的金标准，但对设备、技术要求较高。急性MI后心脏彩超显示节段性室壁运动异常，运动减弱或消失；陈旧MI还显示受累室壁变薄，有僵硬感，左心室收缩和舒张功能下降。本实验兔冠状动脉结扎前、结扎后30 min、建模后4周ECG出现心肌缺血的动态变化；心脏彩超提示术后4周较术前LVEDD和LVESD明显增大，LVFS明显降低。本实验以心电图的动态变化和术后4周LVFS≤35%作为建模成功的标准，术后心肌病理切片证实心肌梗死率100%，以双标准判定建模是否成功，增加了造模成功的可靠性，避免单一标准所导致的误差，且简单易行。
传统人工通气MI模型围手术期死亡率相当高，尤其是小动物可高达35%~50%[14-15]。本实验和Fujita等[4]的实验相比：建模后4周动物死亡率分别为15%(3/20)和29.41%(5/17)，本法稍佳可能与其创伤较小有关；二者造模成功率相似，分别为70%(14/20)和70.59%(12/17)。
本实验不用气管插管和小动物呼吸机，不需人工供氧，不损伤胸膜、肋骨、肋间肌、肋间血管，不用纵断全胸骨，相对以往研究，本实验对设备要求低，操作简单，对动物损伤小，造模成功率高、围手术期死亡率低，成本低，并能提供良好的动物MI实验模型。
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(收稿日期：2012-02-20)(本文编辑：李静)