止消通脉宁干预转化生长因子―β1诱导人肾小管上皮细胞表型转化的研究

摘要：目的 观察止消通脉宁药物血清对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导人肾小管上皮细胞（HK-2）表型转化的影响，并探讨其机制。方法 将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12（1∶1）培养基培养并分为空白对照组、TGF-β1诱导组（TGF-β1 10 ng/mL）、空白血清对照组（TGF-β1 10 ng/mL+10%空白血清）、干预1组（TGF-β1 10 ng/mL+10%低剂量止消通脉宁药物血清）、干预2组（TGF-β1 10 ng/mL+10%中剂量止消通脉宁药物血清）、干预3组（TGF-β1 10 ng/mL+10%高剂量止消通脉宁药物血清）。药物干预24 h后，免疫组化检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达。在24、48、72 h应用酶联免疫吸附法检测细胞培养上清中Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅲ型胶原（ColⅢ）和纤连蛋白（FN）的含量。结果 正常HK-2细胞表达E-cadherin，不表达α-SMA，经TGF-β1刺激后细胞表型发生转变，E-cadherin的表达明显减弱，α-SMA表达明显增强，且ColⅠ、ColⅢ和FN的分泌明显增加，与空白对照组比较差异有统计学意义（P

关键词：止消通脉宁；转化生长因子-β1；人肾小管上皮细胞；表型转化；Ⅰ型胶原；Ⅲ型胶原；纤连蛋白

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）01-0037-03

糖尿病肾病（DN）是糖尿病最为常见的慢性微血管并发症之一，严重影响糖尿病患者的生活质量和生命健康。DN的发病机制尚未明确。既往认为DN的早期病变部位在肾小球，近年来研究发现肾小管病变及肾间质纤维化的程度与肾功能的相关性更为密切，故肾间质纤维化的机制在DN的发展中越来越受到人们的重视[1]。本课题所选止消通脉宁是北京中医药大学东直门医院著名老中医吕仁和教授治疗DN的临床经验方，已在临床作为院内制剂应用多年，在治疗DN方面具有一定的临床疗效[2-4]。本实验通过观察止消通脉宁干预转化生长因子-β1 （TGF-β1）诱导人肾小管上皮细胞表型转化及对细胞外基质成分的影响，进一步探讨其对肾间质纤维化的作用，为其防治DN肾间质纤维化提供依据。

1 实验材料

1.1 细胞株

人肾小管上皮细胞（HK-2），购自兰州大学实验中心。

1.2 动物

Wistar大鼠48只，雄性，体质量（200±20）g，SPF级，甘肃中医学院动物中心提供，许可证号：SCXK（甘）2004-0006。

1.3 药物与试剂

DMEM/F12（1∶1）细胞培养基，Gibco公司生产；胎牛血清，Hyclon公司生产；EDTA、胰蛋白酶，Amresco公司生产；人Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅲ型胶原（ColⅢ）和纤连蛋白（FN）的ELISA试剂盒，RB公司生产；鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）多克隆抗体，Abcam公司生产；兔抗人E-钙黏蛋白（E-cadherin）多克隆抗体，Cell Signaling（CST）公司生产；免疫组化试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。人重组TGF-β1，购自R&D System公司，根据说明书，用含1 mg/mL牛血清白蛋白的无菌弱盐酸（4 mmol/L）配制为1 ?g/mL的储存液，无菌EP管-70 ℃储存，用时配成10 ng/mL浓度[5]。止消通脉宁颗粒（主要由黄芪、生地黄、鬼箭羽、夏枯草、莪术、大黄、三七等药物组成），北京市金药源药物研究院提供，批号20090701，6 g/袋，成人临床用量1袋/次，3次/d。

1.4 仪器

二氧化碳培养箱，HEAL CELL HL90，LIKANG；超净生物安全柜，ESCD CLASSⅡBSC，Airstream；倒置显微镜，Olympus X-71， Olympus，JAPAN；酶标仪，CliniBio 128L-400。

2 实验方法

2.1 止消通脉宁药物血清制备

Wistar大鼠饲养于中国人民总医院屏障级动物实验室[许可证号：SYXK-（军）2007-022]，普通饲料喂养。随机分为空白组及止消通脉宁低、中、高剂量组，每组12只。适应性喂养1周后，中药组分别按成人临床用量的5、10、20倍灌胃给药，空白组灌服同体积生理盐水。给药前将大鼠禁食12 h，使其处于空腹状态，便于药物的吸收。每次1 mL/100 g体质量，上、下午各1次，间隔12 h，连续灌胃3 d。于末次灌胃前8 h禁食不禁水；30 min后，大鼠股动脉无菌采血；静置2 h，3 000 r/min冷冻离心20 min，取上清，将同组血清混合；56 ℃水浴灭活30 min，1.5 mL EP管分装后，-20 ℃低温保存备用。

2.2 细胞培养与分组

HK-2细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 ?g/mL链霉素DMEM/F12（1∶1）完全培养基，于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。每隔2～3 d换新鲜培养基1次，培养融合至80%以上，用含0.25%胰蛋白酶、0.05%EDTA的消化液消化，用完全培养基终止消化后，离心5 min（1 000 r/min）。用新鲜培养基将细胞重悬后进行传代培养。实验前先用无血清培养基培养24 h使细胞同步化，实验重复3次。

传代培养的HK-2细胞分为6组。空白对照组：DMEM/F12培养液；TGF-β1诱导组：DMEM/F12培养液+10 ng/mL TGF-β1；空白血清对照组：DMEM/F12培养液+10 ng/mL TGF-β1+10%空白血清；干预1组：DMEM/F12培养液+10 ng/mL TGF-β1+10%低剂量止消通脉宁药物血清；干预2组：DMEM/F12培养液+10 ng/mL TGF-β1+10%中剂量止消通脉宁药物血清；干预3组：DMEM/F12培养液+10 ng/mL TGF-β1+10%高剂量止消通脉宁药物血清。

2.3 指标检测

2.3.1 细胞免疫化学法检测人肾小管上皮细胞、α-平滑肌肌动蛋白、E-钙黏蛋白的表达

2.3.1.1 盖玻片包被 18 mm×18 mm盖玻片切割成1/4大小，自来水浸2 h，风干后浓硫酸浸泡过夜，自来水清洗干净，95%乙醇浸泡12 h，高压灭菌。使用前将灭菌后的玻片置于24孔板，滴加0.1 mg/mL无菌多聚左旋赖氨酸浸没盖玻片，包被5 min，使多聚赖氨酸充分黏附在盖玻片上，吸干多聚赖氨酸，无菌水彻底冲洗，超净台风干，紫外线照射20 min灭菌备用。

2.3.1.2 细胞爬片制备 于24孔板中包被盖玻片后，细胞以2×104个/mL密度接种，每孔1 mL，孵育24 h，吸弃细胞上清，加入无血清培养液1 mL静止24 h，使其同步化。弃细胞上清，按分组加入含相应浓度药品的培养液，每孔1 mL，继续培养24 h。取出细胞爬片，用0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次。4%多聚甲醛固定20 min，-20 ℃保存备用。

2.3.1.3 细胞免疫化学法染色 3%H2O2去离子水（无色液体）室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水冲洗后PBS浸泡5 min，微波抗原修复，正常山羊血清室温孵育10～15 min封闭非特异结合位点，滴加适当比例稀释的小鼠抗人α-SMA多克隆抗体，或兔抗人E-cadherin多克隆抗体，4 ℃过夜。第2日取出并恢复至室温，PBS冲洗3 min×3次，相继与二抗及ABC试剂各孵育15 min，最后DAB显色和苏木素复染，乙醇梯度脱水后中性树胶封片（细胞爬片倒扣于载玻片上）。显微镜观察细胞形态，并拍照，棕黄色部位为抗原阳性表达部位。

2.3.2 酶联免疫吸附法检测人肾小管上皮细胞Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和纤连蛋白的分泌 细胞以2×104个/mL密度接种于24孔板，每孔1 mL，每组设2个复孔，培养过夜。吸弃细胞上清，加入无血清培养液1 mL静止24 h，使其同步化。弃细胞上清，按分组加入含相应浓度药物的培养液，每孔1 mL。分别于24、48、72 h收集细胞上清，4 ℃、2 000 r/min离心20 min，仔细收集上清，-20 ℃保存待测。指标检测严格按照试剂盒说明书进行。取出细胞上清液，在包被反应条每孔加入不同质量浓度标准品或待测标本100 ?L，空白对照孔中加入稀释液100 ?L， 37 ℃孵育、洗涤、加酶标抗体和终止反应。在酶标仪上450 nm处，以空白对照孔调零，直接测定各孔OD值及样品浓度值。

3 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行分析，数据符合正态分布，结果用―x±s表示，进行方差分析，P

4 结果

4.1 止消通脉宁对转化生长因子-β1诱导人肾小管上皮细胞表型转化的影响

免疫细胞化学法检测结果显示：正常细胞呈卵圆形或近立方形铺路石样，细胞成片生长，胞间连接紧密，胞膜强烈表达E-cadherin，几乎没有α-SMA表达；经TGF-β1诱导后细胞形态出现明显改变，大量细胞拉长为梭形，细胞出现间隙，似成纤维细胞状生长，胞浆强烈表达α-SMA，E-cadherin表达几乎消失；经高剂量止消通脉宁药物血清处理后，α-SMA表达明显减弱，E-cadherin表达明显增强；空白血清没有类似作用。见图1、图2。

4.2 止消通脉宁对转化生长因子-β1诱导人肾小管上皮细胞分泌Ⅰ型胶原的影响（见表1）

（下同）

4.3 止消通脉宁对转化生长因子-β1诱导人肾小管上皮细胞分泌Ⅲ型胶原的影响（见表2）

4.4 止消通脉宁对转化生长因子-β1诱导人肾小管上皮细胞分泌纤连蛋白的影响（见表3）

5 讨论

近年纤维化分子生物学研究表明，肾小管上皮细胞表型转化与肾间质纤维化进程密切相关。表型转化指某种细胞在环境改变时失去其特定的表型特征而获得另一种表型特征，又称作转分化、去分化等。肾小管上皮细胞在炎症、损伤、急性缺血、变性和坏死时可发生表型转化[6]。

关于肾小管上皮细胞转分化的机制尚不十分清楚，目前认为，肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞（Myof）是肾间质纤维化形成的重要机制之一[7]。目前Myof的来源还不完全明确，近年研究发现除了由成纤维细胞活化而来，还有相当一部分来源于肾小管上皮细胞，有报道在肾纤维化的发生过程中，36%的新增纤维细胞来源于肾小管上皮细胞转分化，表型转化的特点是肾小管上皮细胞发生了形态、表型和功能的改变，首先肾小管上皮细胞之间的黏附消失，然后表达肌成纤维细胞标志性蛋白α-SMA，而上皮细胞的标志性蛋白E-钙黏蛋白几乎不表达，随着小管基底膜结构的破坏，细胞获得了移行及浸润的能力，到达间质作用部位分泌基质蛋白，导致纤维化形成[8]。

一些研究表明，某些细胞因子及代谢产物参与了肾小管上皮细胞转分化的发生，其中以TGF-β研究最多，它在多种慢性肾病中大量表达和分泌，被公认为最重要的诱导上皮细胞转分化的细胞因子，而且其他许多细胞因子影响上皮细胞转分化是通过调节TGF-β的生成来发挥作用的[9]。Fan等[5]研究了TGF-β作用于鼠肾小管上皮细胞的效果，发现随着TGF-β剂量增加，α-SMA细胞表达的百分比增加，而表达上皮细胞黏附分子钙黏蛋白的细胞在TGF-β浓度为50 ng/mL培养6 d后完全消失。Yang等[9]报道在单侧输尿管梗阻模型中，TGF-β1诱导上皮细胞转分化的发生，且参与转分化的全过程，是转分化的关键因素。研究表明，TGF-β1在2～10 ng/mL