羟氯喹联合甲氨蝶呤对类风湿关节炎大鼠外周血中IL―1、IL―6和TNF―α的影响

【摘要】 目的：观察羟氯喹联合甲氨蝶呤对类风湿性关节炎大鼠血清白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平变化的影响，探讨羟氯喹治疗类风湿性关节炎的临床效果。方法：建立大鼠类风湿性关节炎模型，将100只大鼠分为正常组、模型组、羟氯喹组、甲氨蝶呤组及羟氯喹联合甲氨蝶呤组（联合组），采用酶联免疫吸附法检测大鼠外周血IL-1、IL-6和TNF-α的水平，并观察大鼠关节肿胀程度。结果：模型组、羟氯喹组、甲氨蝶呤组及联合组大鼠外周血IL-1、IL-6和TNF-α水平均高于正常组，治疗后羟氯喹组、甲氨蝶呤组及联合组大鼠的IL-1、IL-6和TNF-α水平均低于模型组，联合组IL-1、IL-6和TNF-α水平均低于羟氯喹组及甲氨蝶呤组，比较差异均有统计学意义（P0.05）；治疗后与模型组比较，羟氯喹组、甲氨蝶呤组及联合组大鼠的足趾肿胀程度均明显减轻，联合组足趾肿胀程度更低于羟氯喹组及甲氨蝶呤组，比较差异均有统计学意义（P0.05）。结论：羟氯喹在治疗类风湿性关节炎方面具有较好的抗炎作用，能够有效抑制和降低类风湿性关节炎大鼠外周血中IL-1、IL-6和TNF-α水平，且羟氯喹与甲氨蝶呤联合用药治疗类风湿性关节炎的效果更佳。

【关键词】 羟氯喹； 类风湿性关节炎； 白细胞介素-1； 白细胞介素- 6； 肿瘤坏死因子-α

【Abstract】 Objective：To observe the influence of Hydroxychloroquine combined Methotrexate for rheumatoid arthritis in rats serum IL-1，IL-6 and TNF-α level change，to investigate the effect of Hydroxychloroquine in the treatment with rheumatoid arthritis.Method：Rats model of rheumatoid arthritis were established，100 rats were divided into the normal group，model group，Hydroxychloroquine group，Methotrexate group and combined methotrexate hydroxychloroquine group（combination group），the rats peripheral blood IL-1，IL-6 and TNF-α level were detected by enzyme linked immunosorbent assay，the degree of joint swelling in rats were observed.Result：The model group，Hydroxychloroquine group，Methotrexate group and combination group rat peripheral blood IL-1，IL-6 and TNF-α level were all higher than the normal group，after treatment，the Hydroxychloroquine group，Methotrexate group and combination group rats IL-1，IL-6 and TNF-α levels were all lower than the model group，the differences were statistically significant（P0.05）.Compared with the model group after treatment，the Hydroxychloroquine group，Methotrexate group and combination group rats joint swelling degree were significantly reduced，the combination group joint swelling degree was lower than the Hydroxychloroquine group and Methotrexate group，the differences were statistically significant（P0.05）.Conclusion：Hydroxychloroquine in the treatment with rheumatoid arthritis has good anti-inflammatory effect，it can effectively restrain and reduce rheumatoid arthritis rat peripheral blood IL-1，IL-6 and TNF-α level，the Hydroxychloroquine combined Methotrexate in the treatment with rheumatoid arthritis results are better.

【Key words】 Hydroxychloroquine； Rheumatoid arthritis； Interleukin 1； Interleukin 6； Tumor necrosis factor-α

First-author’s address：The Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.26.007

类风湿关节炎（RA）的病因及发病机制尚不清楚，多表现慢性进行性病变，逐渐破坏关节软骨最终导致关节功能损失而致残[1]。RA作为一种系统性自身免疫性疾病，至今尚无特效药，常规治疗多以抗炎、镇痛治疗为主[2]。研究发现白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在RA的病理过程中起到了重要作用，因此通过抑制IL-1、IL-6及TNF-α活性，可能控制RA病情发展[3]。本研究对羟氯喹联合甲氨蝶呤治疗RA大鼠外周血中的IL-1、IL-6及TNF-α的影响进行了实验研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级Wistar大鼠100只，4周龄，体重180～200 g，平均（182.12±18.57）g，包括54只雄性大鼠和46只雌性大鼠，均购买于上海斯莱克实验动物责任有限公司。

1.2 主要药品及实验材料 硫酸羟氯喹片（由长沙鸿德医药贸易有限公司生产，国药准字H20090258），甲氨蝶呤片（由广东祥康药业有限公司生产，国药准字H22022674）；牛Ⅱ型胶原（BCⅡ）、不完全弗氏佐剂（IFA）（均由美国Chondrex公司采购）；IL-1、IL-6和TNF-α试剂盒（均采购自上海森雄科技实业有限公司）。

1.3 模型建立与判定 取适量BCⅡ溶于0.1 mol/L的冰醋酸中，配成浓度为4 mg/mL的BCⅡ溶液，置于4 ℃冰箱内保存过夜后，取等量IFA与BCⅡ溶液混合，振荡充分乳化，制成浓度为2 mg/mL的BCⅡ乳剂，置于4 ℃冰箱保存。按照200 μg BCⅡ/只的剂量对造模组大鼠进行尾根部皮下免疫，并于1周后进行二次免疫，剂量调整为100 μg BCⅡ/只；正常组注射5 mL生理盐水进行尾根部皮下假免疫。判定标准：观察每只大鼠免疫后的足趾关节，至少1个关节出现红肿的大鼠，即为造模成功[4-5]。

1.4 分组及给药方法 随机选取15只大鼠为正常对照组，对剩余85只大鼠进行造模，其中成功60只，失败25只，将60只成功造模的大鼠随机分为模型组、羟氯喹组、甲氨蝶呤组及联合组，每组15只。羟氯喹组、甲氨蝶呤组及联合组分别于免疫后21 d开始灌胃给药，羟氯喹组给予4 mg/（kg・d），每周1次，连用24周；甲氨蝶呤组给予1.2 mg/kg，每周1次，连用24周；联合组为羟氯喹4 mg/（kg・d），甲氨蝶呤组1.2 mg/kg，每周1次，连用24周；模型组灌胃给予等量0.9%氯化钠注射，1次/周，连用24周。

1.5 样本采集 眼眶取血2 mL静置2 h后，放入低温离心机内4 ℃条件下3000 r/min，离心10 min，取上清液冰冻保存备用以检测IL-1、IL-6及TNF-α水平[4]。

1.6 观察指标 足趾肿胀度采用足趾容积测量仪对各组大鼠左后足趾容积进行测量，测量无毛区以下的足趾容积，观察足趾的肿胀程度。测量时间分别为免疫后21 d（治疗前），8周及24周[6-7]。

1.7 统计学处理 使用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用t检验，以P

2 结果

2.1 各组治疗前后大鼠足趾肿胀程度比较 与正常组比较，治疗前后模型组、羟氯喹组、甲氨蝶呤组及联合组大鼠足趾肿胀程度均明显严重于正常组（P0.05）；治疗后，羟氯喹组、甲氨蝶呤组及联合组在第8、24周大鼠足趾肿胀程度均明显改善（P

2.2 第24周各组大鼠外周血IL-1、IL-6和TNF-α水平比较 模型组、羟氯喹组、甲氨蝶呤组及联合组大鼠外周血IL-1、IL-6和TNF-α水平均高于正常组（P

3 讨论

类风湿关节炎（RA）是慢性自身免疫性疾病，病程长，在患病早期主要以滑膜炎为主，发展到后期会造成骨质与软骨破坏，严重者将致残，给患者造成巨大的伤害和痛苦[8]。Ⅱ型胶原诱导关节炎模型（CIA模型）其关节局部病变、自身免疫情况与RA与诸多相似之处，是公认的RA动物模型，因此可以通过CIA模型进行RA的相关基础研究[9]。

虽然目前RA的发病原因及病理机制尚未明确，但是大量研究表明细胞因子的异常及相互作用在RA的发生、发展中起到了重要作用。研究发现RA病灶局部有大量的自身反应性T细胞浸润，并分泌大量的白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）

和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子[10]。IL-1是RA炎症的主要细胞因子之一，通过刺激软骨细胞和滑膜细胞释放细胞毒素，加快软骨及骨质的侵蚀破坏进程[11-12]；IL-6也是一种促炎的细胞因子，通过增加能够放大IL-1β、TNF-α的生物效应的细胞因子，诱导肝脏合成急性期蛋白和类风湿因子，推动RA的病情发展[13]；TNF-α产生于RA的滑膜巨噬细胞中，是一种炎症递质，同时也是破坏性细胞因子，不仅能够造成关节畸形而且可损伤血管，造成局部炎症细胞浸润和水肿[14-15]。Stagakis等[16]研究指出TNF-α水平过高可破坏局部关节组织，加剧病情。由于TNF-α与IL-1往往是同时合成和分泌的，两者可以协调进行骨侵蚀，通过刺激滑膜细胞和软骨细胞释放前列腺素E2、胶原酶，大量的蛋白多糖酶破坏软骨基质，可见TNF-α与IL-1的相互作用加剧了RA病情的进一步发展[17]。

在RA的治疗方面，尚无特效药，多以抗炎、调节机体免疫为主，甲氨蝶呤是目前在RA治疗中应用较多的药物，具有较强的抗炎和免疫抑制作用[18]。但是临床证实，甲氨蝶呤具有较强的副作用，服用后可引起恶心、呕吐甚至会导致肝功能损害，因此在服用甲氨蝶呤治疗RA时需要定期检测肝肾功能，较强的副作用给RA患者造成巨大的痛苦。羟氯喹是4-氨基喹诺酮类抗疟药，主要通过抑制抗原递呈细胞的递呈功能和组织IL-21的释放，起到抑制纤维细胞增殖，减少炎性渗出的作用，在治疗RA方面效果显著[19]。张舸等[20]通过观察羟氯喹治疗类风湿关节炎患者的临床效果发现，类风湿性关节炎患者的关节滑液局部的IL-1α和IL-6水平均明显降低。本研究结果表明，模型组CIA大鼠的外周血IL-1、IL-6和TNF-α水平均明显高于正常大鼠，给予药物治疗后，羟氯喹组与甲氨蝶呤组的大鼠的外周血IL-1、IL-6和TNF-α水平均明显降低，且两组的水平相近，这表明羟氯喹在治疗RA方面与甲氨蝶呤一样具有较好的抗炎作用，因此证实了羟氯喹在治疗RA方面具有明显的临床效果。同时，本研究还发现，羟氯喹联合甲氨蝶呤使用，在降低CIA大鼠外周血IL-1、IL-6和TNF-α水平方面的效果更优于单独使用羟氯喹和甲氨蝶呤。

综上所述，羟氯喹能够有效降低CIA大鼠外周血IL-1、IL-6和TNF-α水平，在治疗RA的过程中通过抑制细胞因子的产生及相互作用，能够有效起到抗炎和调节机体免疫的作用，在治疗RA方面具有显著效果。同时，羟氯喹联合甲氨蝶呤也是治疗RA的不错方案，起效快，效果更佳，但是由于本研究样本量小、时间短，其安全性还有待进一步观察。

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（收稿日期：2016-05-03） （本文编辑：李颖）