RP-HPLC法测定鬼箭羽中3种活性成分的含量

高　媛　方宪康　朱丹妮

摘　要：目的：建立同时测定鬼箭羽中降糖活性成分山柰酚、柚皮素及槲皮素含量测定的方法。方法：采用反阳高效液相色谱法，以Alltima C18(4.6mm×250mm，5μm)为色谱柱，乙腈0.1％甲酸(38：62)为流动相，检测波长258nm，流速0.8mL/min，柱温30℃。结果：山柰酚、柚皮素及槲皮素的线性范围分别为0.02064－0.2580μg(r＝0.9996)。0.05592－0.699gg(r=0.9997)，0.01656－0.207μg(r=0.9998)；加样回收率分别为100.6％(RSD=2.5％)，96.4％(RSD=1.1％)，101.9％(RSD=1.7％)。结论：本法简便、准确、重现性好，适用于鬼箭羽中3种活性成分的同时测定，可用于鬼箭羽药材的质量控制。

关键词：鬼箭羽；山柰酚；柚皮素；槲皮素；高效液相

中图分类号：R284.1　文献标识码：A　文章编号：1673－7717(2007)07－1441－03

鬼箭羽为卫矛科植物卫矛[Euonymus alatus(Thunb.)Sieb.]的翅状附属物或其嫩枝，分布于我国北部、中部、华东以及西南各地。其味酸甘涩，性微寒，能通经活血，民间使用鬼箭羽治疗治疗糖尿病取得了较好的效果；在韩国和日本多用于抗肿瘤。本实验室发现鬼箭羽的提取物能显著降低糖尿病模型小鼠Kkay的血糖，增加外周组织对胰岛素的敏感性。对鬼箭羽化学成分及作用机制研究表明：鬼箭羽中山柰酚、柚皮素及槲皮素等成分能激活过氧化物增殖剂受体(PPAR)(研究论文另行发表)。过氧化物增殖剂受体(PPAR)为糖尿病一线治疗药物罗格列酮，比格列酮的分子靶位。鬼箭羽提取物中的有效成分具有过氧化物增殖剂受体(PPAR)的激动活性的这一研究结果至少部分阐明了该植物的物质作用机制，对深入挖掘该植物的药用价值及药材的质量控制等方面也有积极的推动作用。目前鬼箭羽药材常用于中药验方及成药中，然而其质量控制方法尚未见报道，其根本原因是其中的活性化学成分尚未阐明。基于本实验室的化学成分及作用机制的研究结果，本文首次建立了鬼箭羽3种有效成分的含量测定方法，并对不同收集地的鬼箭羽药材进行了含量测定。从而为有效评价药材的内在质量，控制中药成药的生产质量奠定基础。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪Waters600E－996(美国Waters公司)，包括Waters600E，996PDA检测器，Millennium32工作站；色谱柱；十万分之一天平(MZITLER AE240)；KQ－100DE型医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，100ttL微量进样器。

鬼箭羽药材由江苏、浙江、安徽等地收集，经本校生药学余伯阳教授鉴定为卫矛科植物Euonymus alatus(Thunb.)Sieb.的翅状附属物和其嫩枝。

对照品山柰酚、柚皮素及槲皮素均为自制，经MS、1HNMR、12CNMPt鉴定结构，HPLC测定纯度达98％以上。

色谱纯乙腈(Merck公司)、色谱纯甲醇(江苏汉邦科技有限公司)，纯净水(乐百氏公司)；甲酸(AR，南京化学试剂厂)；乙醇(AR，南京化学试剂一厂)。

2　方法与结果

2．1 色谱条件，色谱柱： Alltima C18column(4.6mm×250mm，5μn)，流动相：乙腈－0.1％甲酸(38：62)(梯度洗脱：0－10min，乙腈25％38％；10－30min，乙腈38％)；检测波长：258nm；柱温：30℃；流速：0.8 mL/min。

2．2 溶液的制备①对照品溶液的配制：精密称取山柰酚、柚皮素及槲皮素对照品适量于同一量瓶中，加甲醇分别配制成山柰酚为0.0344mg/mL、柚皮素为0.0932mg/mL及槲皮素为0.0276mg/mL的溶液，作为对照品溶液。②供试品溶液的制备：精密称取样品细粉(过80目筛)0.6g于具塞：角烧瓶中，加入25 mL 75％乙醇，超声处理30min，用中速分析滤纸滤过，滤渣再加75％乙醇25 mL超声处理1次，滤过，合并滤液，减压回收溶剂，残渣加75％乙醇溶解并转移至5mL容量瓶中，加75％乙醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液，备用。

2．3 标准曲线的制备精密吸取上述对照品溶液60、100、220、450、550、750μL，分别置于2mL量瓶中，加75％乙醇至刻度，摇匀，制成系列浓度的对照品溶液。用0.45μm微孔滤膜滤，取续滤液按上述色谱条件进行测定，记录峰面积，分别以山柰酚、柚皮素及槲皮素样品浓度(μg/mL)为横坐标，以峰面积为纵坐标，得回归方程分别为：山柰酚：Y＝62646X－15589，r＝0.9996(n=6)；柚皮素：Y=13457X－229.6，r=0.9997(n=6)；槲皮素：Y=65200X－14972．r=0.9998(n=6)。结果表明，山柰酚在0.02064－0.2580μg范围内、柚皮素在0.05592－0.699μg范围内，槲皮素在0.01656－0.207μg范围内，对照品浓度和其峰面积具有良好的线性关系。

2．4 最低检测阪及定量限，在选定的色谱条件下，当信噪比为3时，对各组分的最低检测限进行测定，结果表明，山柰酚、柚皮素及槲皮素的最低检测限分别为0.2、0.76、0.176ng。在选定的色谱条件下，当信噪比为10时，对各组分的定量限进行测定，结果表明，山奈酚、柚皮案及槲皮素的定量限分别为0.6、3.04,0.528ng。

2．5 精密度试验精密吸取上述对照品贮备液20μL，重复进样6次，考察仪器精密度，结果表明仪器精密度良好，其RSD分别为1.62％、1.42％、1.65％。

2．6 重复性试验称取鬼箭羽细粉，按照“供试品溶液制备”方法制备6份，以上述色谱条件下进行分析，计算山柰酚、柚皮素及槲皮素的含量，考察方法重复性，结果表明方法重复性良好，其RSD分别为1.77％、0.96％、2.53％。

2．7 稳定性试验精密吸取新制备的供试品溶液20μL，按上述色谱条件分别于O、6、12、24、36、48h进样分析，记录色谱峰面积，结果表明供试品溶液在48h内稳定。

2．8 加样回收率试验精密称取已知含量的样品9份，分别精密加入高、中、低3种浓度的对照品溶液，按照“供试品溶液制备”方法制备后，在上述色谱条件下进行分析，计算回收率。

2．9 样品测定，取鬼箭羽细粉，按照“供试品溶液制备”方法制备，以上述色谱条件下进行分析，记录色谱图(见图1)。计算山柰酚、柚皮素及槲皮素的含量，测定结果见

3 讨　论

3．1 提取溶剂的选择分别比较了甲醇、95％乙醇、70％乙醇、75％乙醇及乙酸乙酯作为提取溶剂同法处理药材粉末，含量测定结果表明，选用75％乙醇时峰形最好，且目标物含量较高，故选用75％乙醇作为该方法的提取溶剂。

3．2 提取方法的选择分别比较了超声提取、回流提取及索氏提取3种方法，其中回流提取及索氏提取法提取效率不高，超声提取效率高且操作简单，故选择超声提取法。进而对超声提取的时间进行考察，分别比较了超声0.5h；超声2次，每次0.5h；超声3次，每次0.5h；结果发现，超声2次，每次0.5 h即可将其提取完全，因而选用超声2次，每次0.5h。

3．3　小结，山柰酚、柚皮素及槲皮素均为鬼箭羽中的活性成分，在药材中含量较低，进行梯度洗脱时基线有所漂移。

由5个收集地样品的测定结果可看出，各收集地的3个活性成分各有差异，浙江及安徽样品含量较高，本法简便易行，可用于评价鬼箭羽药材的质量以及提取工艺条件的控制。