巴戟天水提取物对人顶体氧化损伤的保护作用

杨　欣　张永华　丁彩飞　颜志中　杜　静

摘　要：目的：观察巴戟天水提取物对人顶体结构和功能氧化损伤的保护作用，探讨巴戟天治疗男性不育症的作用机制。方法：采用Percoll梯度离心法选择具有正常生理功能的作为模型，应用次黄嘌吟－黄嘌呤氧化酶(HX－XO)体系产生活性氧(ROS)，在有氧环境下，ROS、不同剂量的巴戟天水提取物与悬液共同孵育后，检测顶体完整率，透射电镜观察顶体和超微结构，并与已知的抗氧化剂维生素C对照。结果：在ROS作用下，的顶体受损，顶体完整率明显下降，与正常者相比差异极显著(P＜0.001)，巴戟天水提取物小、中、大剂量组在相同条件下均可明显减轻ROS对顶体所造成的氧化损伤程度，与VitC相比较，0.25和O.5g/mL巴戟天水提取物的作用更明显(P＜0.05，P＜0.01)。结论：适宜剂量的巴戟天水提取物对ROS所致人过氧化损伤具有明显干预作用，对顶体结构和功能具有保护作用。

关键词：巴戟天；；顶体；氧侣损伤

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673－7717(2007)07－1423－02

顶体缺陷与男性不育有着密切关系。研究表明，活性氧类(Reactive Oxygen Species，ROS)所介导的脂质过氧化作用可引起结构与功能改变，是男性不育的一个重要病因。传统中药巴戟天(Morinda officinalisHOW.)具有补肾阳、强筋骨、祛风湿功效，是治疗男性不育症的常用药物。笔者实验研究表明，巴戟天水提取物能显著改善运动功能，对膜功能具有保护作用。本实验采用体外培养的方法，在有氧环境下，观察巴戟天水提取物对ROS所致人顶体结构和功能氧化损伤的保护作用。试图为应用中药巴戟天治疗男性不育症提供实验依据。维生素C是一种水溶性的ROS高效清除剂，还具有还原剂的性质，在细胞内外起着重要的清除氧自由基和抗脂质过氧化作用，因此本实验以其为阳性对照药。

1　材料与方法

1．1　主要仪器和试剂

WLIY－9000伟力彩色质量检测系统(配有恒温装置，北京伟力新世纪科技发展有限公司)，2K15C11加热型冷冻高速台式离心机(德国sigma公司)，FOtLMA－3111水套式二氧化碳细胞培养箱(美国热电公司)，JEM－1200EX透射电镜(日本JEOL公司)。

Percon液(Sigma公司，批号：P7828)，10×Earle’s液(Sigma公司，批号：E7510)，1×Earle’s液(Sigma公司，批号：E7883)，次黄嘌呤(HX，Sigma公司，批号：X－1882)，黄嘌呤氧化酶(XO，Sigma公司，批号：X－1875)，维生素C(VitC，Sigma公司，批号：A－7506)。90％和45％Percoll液的制备参见文献。

1．2　正常模型制备

25－35岁的健康且有生育能力的自愿供精者15名，禁欲3－5天，留取于干燥无菌容器，经计算机辅助分析(computer－aided sperm analysis，CASA)系统常规分析，密度＞60×106/mL，a级>25％，a+b级＞50％，正常形态＞60％，WBC＜1×100/mL。采用Percoll梯度离心法制备具有正常生理功能的悬液。具体操作如下：在14mL离心管中先加入2mL 90％Per-coil，在其上层轻缓加入2mL 45％Percoil，然后在45％Per-coil的上层轻缓加入2mL已液化的；300r/min离心20min；吸去层和45％Percoll层，将90％Percoil层与4mL的Earle’S液混匀，300f/min离心10min，弃上清，沉淀用适量Earle’s混悬，并调数为20×106/mL。

1．3　药物来源及制备

1．3．1 来源 巴戟天购自浙江省医药公司，经本院杜静主任药师鉴定确认为茜草科植物巴戟天Morinda　officinalisHow的干燥根。

1．3．2　制备由本院制剂室制备。取巴戟天若干加10倍量双蒸水浸泡300min，煎煮30min，滤布过滤，滤渣再加5倍量水同上法再处理2次，各煮沸30和15min，合并3次滤液，用聚乙烯微孔滤管在减压下过滤，除去煎出液中的悬浮粒子，滤液于70－80℃水浴中浓缩至每1mL药液相当于0.5g生药量，冷藏保备用。

1．4　方　法

1．4．1　分组将悬液分为6组：正常组为PBS缓冲液(pH7.4)；模型组为HX―XO(HX终浓度为1mmol/L,XO终含量为50 mU/mL；阳性药对照组为维生素C(终含量为0.25mg/mL)+HX－XO(终浓度/含量同模型组)；巴戟天小、中、大剂量组为巴戟天水提取物(终含量分别为0．125、O.25、0.5g/mL)+HX－XO(终浓度/含量同模型组)；各组样本置37℃，5％CO2培养箱中孵育1－2h。

1．4．2　观察指标及方法①顶体完整率：各组悬液孵育2h后，取样5μ涂片，95％乙醇固定10min，自然干燥；瑞一姬氏染液染色60s，瑞一姬氏染液加等量PBS(pH6.9)再染10min；自来水冲洗，染片置于95％乙醇中浸泡2－5s，脱掉片膜上的浮色，自然干燥，光学树脂封片，置于油镜下镜检。计数200条，求出顶体完整率(即顶体完整所占的百分率)。顶体完整率(％)=顶体完整的数/总数×100％。②电镜标本的制备及透射电镜观察：各组悬液孵育1h，2000r/min离心10min，轻轻吸去上清；沿管壁缓慢加入2.5％戊二醛，静置4℃固定4h；取出固定的凝块，切成1mm×1mm×1mm24块，用0.1mmol/L PBS缓冲液漂洗4－6次(0.5－2.0h/次)，再经1％锇酸后固定(4℃，1.5h)，按照电镜制样常规脱水、浸透，环氧树脂Epon812包埋和聚合，超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，JEM－1200EX透射电镜观察的超微结构。

1．5　统计学方法

结果用x±s表示，采用SPSS12.0统计软件包进行方差齐性检验和单因素方差分析。

2　结　果

2．1　顶体完整率

ROS作用后顶体膜结构明显受损，维生素C组和巴戟天水提取物小、中、大剂量组的顶体完整率均显著低于正常组。但高于模型组(均P＜0.001)；巴戟天水提取物中、大剂量组的顶体完整率显著高于VitC组(P＜0.05，P＜0.001)，见表1。

2．2　顶体超微结构观察

透射电镜观察，正常组形态正常，顶体超微结构完

整，与文献资料中正常基本一致。模型组头部发生不同程度的损伤，顶体超微结构明显异常，膜与顶体结构完整性发生改变，膜破损，顶体呈节段性断裂，形成串珠状小泡，甚至顶体帽脱落。维生素C组和巴戟天水提取物小、中、大剂量组的膜结构、顶体结构异常程度与模型组相比明显减轻，以巴戟天水提取物大剂量组最明显，并可见到头部结构完整的，但结构完整程度明显少于正常组。

3　讨　论

顶体(acrosoIne)是哺乳动物和人类头部覆盖于核前2/3以上区域的囊性结构，顶体内富含多种蛋白水解酶(顶体酶)，在穿过卵子放射冠、透明带等受精过程中，顶体酶发挥主要作用。顶体完整率与顶体内酶的含量和活力明显相关。顶体异常通常伴随顶体酶质和量的改变，故顶体结构完整性与功能相关，也是评价功能的重要指标之一。

本实验采用次黄嘌呤一黄嘌呤氧化酶体系。使氧发生单价和双价还原反应，产生0-2和H2O2。后者可使膜上多聚不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应。通过观察ROS对离体正常人的过氧化作用，研究了巴戟天水提物对人顶体结构和功能氧化损伤的保护作用。结果显示，在ROS介导的过氧化作用下，对膜和顶体结构造成了损伤，的顶体完整率显著下降(均P＜0.001)，在悬液中分别加入维生素C和不同剂量的巴戟天水提取物后顶体完整率得以改善，说明维生素C和巴戟天水提取物都能对膜和顶体结构起到保护作用。终含量0.25，0.5g/mL的巴戟天水提取物的作用明显优于维生素C(P＜0.05，P＜0.001)。透射电镜观察结果表明，ROS介导的过氧化反应对顶体超微结构的损伤，主要表现为膜与顶体结构完整性发生改变．膜破损，顶体呈节段性断裂，形成串珠状小泡。与模型组相比，巴戟天水提取物大、中、小剂量组的顶体超微结构异常程度相对减轻，其中以大剂量组损伤程度最轻，这一结果与顶体完整率的改变相一致。本实验结果表明，适宜剂量的巴戟天水提取物对ROS所致人顶体的过氧化损伤具有明显干预作用，对顶体结构和功能具有保护作用。