全反式维甲酸对胃癌BGC823细胞增值和凋亡的影响及其机制研究

【摘要】 目的 探讨全反式维甲酸(alltrans retinoic acid,ATRA)对体外培养的胃癌BGC823细胞增殖和细胞凋亡的影响。方法 不同浓度全反式维甲酸处理培养的胃癌BGC823细胞后,采用MTT法检测细胞的增殖活性,采用TUNEL法检测细胞凋亡情况,采用RTPCR检测细胞Survivin基因mRNA的变化。结果 全反式维甲酸对胃癌BGC823细胞的生长具有明显的抑制作用,其作用表现为剂量依赖性和时间依赖性(P

【关键词】胃癌;BGC823;全反式维甲酸;细胞增殖;凋亡;Survivin

Effect of ATRA on proliferation and apoptosis of human BGC823 gastric cancer cell

SHI Guangyong. Oncology Department, The Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China

【Abstract】 Objective To observe the effect of alltrans retinoic acid(ATRA)on proliferation and apoptosis of human gastric cancer cell line BGC823 and its mechanisms.Methods BGC823 cells were treated with different concentration of ATRA.The cell proliferatiwas measured by methabenzthiazuron(MTT)assay and the apoptosis induced by ATRA was evaluated by TUNEL assay.The Survivin mRNA expression levels were detected by RTPCR.Results ATRA inhibited growth of BGC823 cells in a dosedependent and timedependent manner(P

【Key words】Gastric cancer; BGC823; Cell proliferation; Apoptosis; ATRA; Survivin

作者单位:450052郑州大学第五附属医院肿瘤科

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤。虽然近年来在其诊治方面取得了一些成绩,但预后仍不理想,我国胃癌的死亡率仍居恶性肿瘤之首。全反式维甲酸(alltrans retinoic acid,ATRA)是肿瘤诱导分化剂,对多种肿瘤细胞有诱导分化和促进凋亡作用[1],但是其具体机制还不是很清楚。本研究应用全反式维甲酸作用于人胃癌BGC823细胞,来探讨其对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制,为其临床应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 胃腺癌细胞株BGC823购自中国科学院细胞库。TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒购自洛阳华美生物工程公司。全反式维甲酸(美国Sigma公司),RPMI1640培养基(solarboi公司),四甲基偶氮唑蓝(MTT,美国Sigma公司),二甲基亚矾(DMSO,美国Sigma公司),全自动Fax2100酶标仪(英国stat公司)。Survivin(sc10811)兔抗人多克隆抗体、通用型SP Kit(SP9000)免疫组化试剂盒和DAB kit(ZLI9032)免疫组化试剂盒均购自北京中杉生物技术有限公司。Trizol、异丙醇和酒精购自Sigma公司;逆转录试剂盒购和dNTP Mixture购自大连宝生物公司;Taq DNA聚合酶(Promega公司);PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 细胞的培养 应用10%灭活胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养液中(青霉素和链霉素各100 u/ml)培养BGC823细胞,置37℃、体积分数为5% CO2、饱和湿度培养箱中传代培养,所有试验用细胞均为处于对数生长期细胞。全反式维甲酸溶于二甲基亚砜制成10 mmol/L的母液,20 4℃冰箱避光贮存备用。

1.3 MTT检测细胞抑制率 消化收集胃癌BGC823细胞后计数并调整细胞浓度为按100 μl/孔细胞悬液(7.5×104个细胞/ml)接种于96孔板,加入全反式维甲酸终浓度分别为0.1、0.5、1、5、10 μmol/L的培养液,每一浓度设6个复孔,设阴性对照和空白对照孔4个,继续培养12、24、36、48、60、72 h。倒置显微镜观察药物作用后的BGC823细胞形态的变化。每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl,培养箱内继续孵育4 h,终止培养,加人DMSO震荡混匀,在自动酶标仪上以570 nm波长测定各孔吸光度OD值。抑制率=(1实验药物组OD值/空白对照组OD值)×100%。同样实验重复3次。

1.4 凋亡指数的检测 采用DNA末端原位标记染色法(TUNEL)检测1 μmol/L全反式维甲酸作用胃癌细胞0(对照)、12、24、48 h后凋亡情况,统计细胞凋亡指数(apoptosis index,AI)。步骤严格按照洛阳华美生物工程公司提供的TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。光镜下数5个高倍镜>l000个细胞,以背景无颜色,细胞核着棕黄色者为阳性细胞。分别计数总细胞数量和凋亡细胞数量。按下面公式计算凋亡指数(AI),凋亡指数(AI)=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。

1.5 RTPCR检测Survivin基因mRNA表达的变化 采用Trizol抽提法提取1 μmol/L的全反式维甲酸分别作用0、24、48、72 h后的总RNA;逆转录合成cDNA。Survivin引物上游5’AGAACTGGCCCTTCTTGGA3’;下游5’AAGGAAAGCGCAACCGGACG3’,退火温度58 ℃,扩增片段长194 bp。βactin引物:上游5’ATGGCACCGTCAAGGCTGAG3’;下游5’GCAGTGATGGCATGGACTGT3’,扩增片段长379 bp。PCR反应操作均严格按照试剂盒说明进行,反应体系25 μl,扩增条件:94℃ 5 min;94℃ 30′,54℃ 30′,72℃ 60′,重复30个循环;72℃ 10 min。反应完成后取5 μl PCR产物加loading buffer混合后进行琼脂糖凝胶电泳。应用凝胶成像仪扫描成像,经图象分析处理后,按下面公式计算Survivin mRNA相对含量:Survivin mRNA相对含量=(Survivin mRNA光密度/βactin mRNA光密度)×100%。

1.6 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析和t检验,数据用x±s表示,检验水准χ2=0.05,P

2 结果

2.1 光镜下细胞形态的变化:加入药物细胞培养12 h后,光学显微镜下观察。部分BGC823细胞边缘不整,出现皱缩、变圆、脱落和漂浮细胞增多;部分细胞体积缩小,细胞解离成彼此黏附成簇的圆形小体凋亡小体。

2.2 全反式维甲酸对人胃癌BGC823细胞增殖的抑制作用 MTT结果(图1)显示,全反式维甲酸均能够显著抑制人胃癌BGC823细胞的体外生长,其对胃癌BGC823细胞的生长抑制作用随着全反式维甲酸浓度的升高而增加;并且在同一浓度组中,全反式维甲酸对胃癌BGC823细胞的抑制作用随时间的延长明显增加,其差异具有显著性(P

图1 全反式维甲酸抑制人胃癌BGC823细胞生长的时效和量效关系

2.3 全反式维甲酸对人胃癌BGC823细胞凋亡指数的影响 全反式维甲酸可以明显诱导人胃癌BGC823细胞凋亡细胞,经1 μmol/L浓度全反式维甲酸作用24、48、72 h后,细胞凋亡指数分别从作用前的(3.34±1.15)增加至(12.6±1.91)、(21.45±3.76)、(32.57±2.71)。而统计学分析不同时间组间有显著性差异(P

2.4 RTPCR检测Survivin mRNA表达的变化 RTPCR检测1 μmol/L浓度全反式维甲酸作用人胃癌BGC823细胞0、24、48、72 h后细胞中Survivin mRNA表达情况。结果(图2)发现,全反式维甲酸下调人胃癌BGC823细胞中Survivin mRNA表达,表达情况随着全反式维甲酸作用时间的延长而逐渐下降,呈现一定的时间依赖性关系。

图2 全反式维甲酸作用0、24、48、72 h后 Survivin mRNA表达情况

M:marker; 1:对照(0 h); 2:24 h; 48 h; 4:72 h

3 讨论

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,具有发病率高、发病隐匿、易转移和死亡率高等特点。目前胃癌的主要治疗是实行综合治疗即手术、放疗、化疗等手段的合理应用。虽然近年来胃癌的诊断和治疗技术已有很大提高,但胃癌患者总的生存率仍然很低,疗效不能令人满意。近来很多新辅助化疗研究结果表明,对于局部进展期的消化系统肿瘤使用新辅助化疗后,无论是手术或同步化放疗均有助于提高治愈率和生存质量[2]。维甲酸是促进上皮组织分化生长及维持其正常功能不可缺少的物质,很多研究表明维甲酸能够在细胞水平上诱导多种实体肿瘤细胞的分化,进而抑制肿瘤细胞的增殖[3]。第三代维甲酸全反式维甲酸(alltrans retinoic acid,ATRA)目前构型最为稳定,作为维甲酸类的代表,是目前研究较多和较为成熟的维甲酸类药物[4]。MTT结果发现在不同浓度和作用时间下,全反式维甲酸均不同程度的抑制人胃癌BGC823细胞的增殖,其增殖和抑制作用表现为剂量和时间依赖性。

研究表明,体内肿瘤的发生是由于细胞生长的失控及对凋亡信号的拮抗而引起的。凋亡(apoptosis)是自然界普遍存在的现象,凋亡程序的启动受到多种促凋亡及凋亡抑制蛋白的调控。而凋亡抑制蛋白表达升高与肿瘤的发生密切相关,诱导肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤的新思路,临床上使用的放射疗法和大多数化疗药物均都可通过诱导肿瘤细胞凋亡而显示疗效[5]。为此笔者观察了全反式维甲酸对人胃癌BGC823细胞凋亡的影响:结果发现全反式维甲酸可以明显诱导人胃癌BGC823细胞凋亡,与对照组相比不同时间实验组凋亡率有显著性差异,并作用时间的延长呈时间依赖性升高。结果提示诱导凋亡可能是全反式维甲酸抗肿瘤作用的重要机制之一。

凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族是一类广泛存在于酵母、昆虫及哺乳动物细胞中的进化上高度保守的细胞死亡抑制分子。Survivin是新近发现的IAP家族成员,具有调控细胞分裂和抑制细胞凋亡的双重功能,是目前发现的作用最强的凋亡抑制蛋白。Survivin在早期胚胎时期表达非常广泛,而在正常成人仅表极少数组织。然而,Survivin却在肺癌、乳癌、胃癌、结肠癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、甲状腺癌、鼻咽癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、白血病和皮肤黑色素瘤等多种肿瘤组织中过度表达[6],更为重要的是抑制了该肿瘤Survivin的表达可以显著降低该肿瘤细胞的增殖能力。本实验观察了全反式维甲酸对人胃癌BGC823中凋亡抑制基因Survivin表达的变化。结果显示,全反式维甲酸可以显著下调人胃癌BGC823细胞Survivin的表达,随着全反式维甲酸作用时间的延长Survivin表达的下调增强,实验组和对照组之间差异有统计学意义。

综上所述,全反式维甲酸在体外可以显著抑制人胃癌BGC823细胞的增殖,并能诱导肿瘤细胞的凋亡,其诱导细胞凋亡的机制可能与Survivin表达的下调密切相关。

参 考 文 献

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