PRRSV感染不同时期IFN—γ表达量分析

摘要 以猪干扰素γ为研究对象，采用实时荧光定量PCR及ELISA的方法分析在PRRSV感染不同时期猪体内γ干扰素的基因相对表达量及蛋白表达量的变化情况，结果表明：在PRRSV感染后5、7、10 d IFN-γ基因相对表达量都有升高表现。而1～3 d没有明显变化；通过ELISA方法对血清中IFN-γ蛋白表达量进行测定，发现接毒试验组的猪血液中IFN-γ蛋白表达量在接毒后的1～3 d内低于正常对照组，5 d后明显升高且高于正常对照组，7 d时达到最高峰。采用荧光定量相对定量方法测定接毒后猪血液中IFN-γ蛋白表达量，发现接毒试验组的猪血液中IFN-γ蛋白表达量与正常对照组相比，在1～3 d无显著差异，于5 d后明显升高，10 d时达到最高，14 d时快速下降至与正常对照组无显著差异。

关键词 蓝耳病；IFN-γ；荧光定量PCR；ELISA；表达量

中图分类号 R392 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）05-0275-02

猪繁殖与呼吸综合征（又称蓝耳病）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的猪的一种高度接触性传染病。该病以母猪流产、死胎、弱仔、木乃伊胎以及仔猪呼吸困难、败血症、高死亡率等为主要特征[1-2]。干扰素（interferon，IFN）是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和增强免疫功能的细胞因子[3]，T细胞产生的为γ型。γ干扰素是效应T细胞的重要效应分子，主要由活化的T细胞和NK细胞产生[4]，具有抗病毒感染和抗肿瘤等作用。大量研究表明，IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10等细胞因子的表达变化，可作为T淋巴细胞免疫功能评价的重要指标，用于病毒感染后宿主免疫机制的研究及病毒疫苗诱发免疫效应的评价[5-8]。鉴于此，本研究运用实时荧光定量PCR及ELISA等实验室技术对PRRSV感染不同时期猪血液中干扰素γ及蛋白表达量的变化情况进行检测和分析，以便能够更好地了解在PRRSV感染不同时期IFN-γ量的变化，从而了解IFN-γ与PRRSV抗感染之间的关系，进行科学检测、正确分析，才能得到准确的猪场PRRSV感染信息，进而安排合理的免疫程序，达到最佳的免疫控制效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从购买断奶仔猪（35日龄）后，所有猪只均未接种疫苗，经采血进行HCV、PRV、PCV-2、PRRSV、MHP、APP检测均为阴性。符合试验要求的36头仔猪随机分为2组，每组18头，其中1组为试验组，另一组为不接种病毒的对照组。

1.2 仪器设备与试剂

高速冷冻离心机、核酸定量仪购至Thermo公司；普通PCR仪、荧光定量PCR仪、荧光定量PCR，购于BIO-RAD公司；数显恒温水浴锅HH-4，购于国华电器有限公司；总RNA提取试剂RNAisoTMPlus、SYBRRPrime Ex TaqTMⅡ、反转录试剂、内切酶提取试剂盒均购于大连宝生物公司，ELISA试剂盒购自RD公司。

1.3 试验方法

1.3.1 接毒。采用滴鼻接种PRRSV的方法人工感染试验组仔猪。将36头仔猪随机分为2组，每组18头，其中1组为试验组，对照组不接种病毒作为空白对照，在相同条件下饲养观察。分别于感染后的第1、3、5、7、10、14天宰杀试验组和对照组仔猪各3头，采集血液。一部分用来提取总RNA，用于荧光定量试验；一部分用来析出血清，用于ELISA试验。

1.3.2 血液中IFN-γ表达量检测。分别在接种毒株后第1、3、5、7、10、14天对每头猪采血检测IFN-γ基因与蛋白表达量。

1.3.3 血液中细胞因子IFN-γ mRNA表达水平的变化的检测。用Trizol试剂提取各个组猪血液的总RNA，以总RNA为模板用反转录试剂合成cDNA，之后通过实时荧光定量PCR的方法检测不同时段接毒与对照组猪血液中细胞因子IFN-γ基因表达水平的变化。

1.3.4 血清中IFN-γ蛋白含量进行的测定。对血清中IFN-γ蛋白含量进行测定采用ELISA[9]的方法进行，具体步骤如下：从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压实自封条，密封口袋，放回4 ℃。

2 结果与分析

2.1 ELISA法测定接毒后猪血液中IFN-γ蛋白表达量

通过ELISA方法对血清中IFN-γ蛋白表达量进行测定，结果如图1所示。从图1可以看出，接毒试验组的猪血液中IFN-γ蛋白表达量在接毒后的1～3 d内低于正常对照组，5 d后明显升高且高于正常对照组，7 d时达到最高峰。

2.2 荧光定量PCR测定接毒后猪血液中IFN-γ蛋白表达量

荧光定量相对定量方法测定接毒后猪血液中IFN-γ蛋白表达量结果见图2。从图2可以看出，接毒试验组的猪血液中IFN-γ蛋白表达量与正常对照组相比，在1～3 d无显著差异，于5 d后明显升高，10 d时达到最高，14 d时快速下降至与正常对照组无显著差异。

3 结论与讨论

本研究利用实时荧光定量PCR以及ELISA实验技术检测PRRSV感染后不同时期IFN-γ基因相对表达量的动态变化。结果表明，在PRRSV感染后5、7、10 d，IFN-γ相对表达量都有升高表现。而1～3 d没有明显变化，说明该时期可能是处于病毒感染初期，因此还没有分泌IFN-γ的明显变化，而到了第14天时IFN-γ表达量降低是因为此时试验动物已经接近死亡，所以各项指标都已经下降，而在第5、7、10天时显著升高，这是因为γ干扰素表达的因子能促进抗PRRSV的细胞免疫应答；γ干扰素还可以抑制PRRSV在体外培养的细胞中增殖，这就说明γ干扰素可能和PRRSV的抗感染具有一定相互作用，IFN-γ可诱导巨噬细胞、B细胞等细胞MHCⅡ类分子和协同刺激分子的表达，提高抗原递呈能力，诱导Thl型免疫应答，在免疫调节、抗病毒感染等方面起着非常重要的作用，γ干扰素可能在一定程度上抑制了PRRSV的持续感染。

通过ELISA方法对血清中IFN-γ蛋白表达量进行测定，发现接毒试验组的猪血液中IFN-γ蛋白表达量在接毒后的1～3 d内低于正常对照组，5 d后明显升高且高于正常对照组，7 d时达到最高峰。采用荧光定量相对定量方法测定接毒后猪血液中IFN-γ蛋白表达量，结果表明接毒试验组的猪血液中IFN-γ蛋白表达量与正常对照组相比，在1～3 d无显著差异，于5 d后明显升高，10 d时达到最高，14 d时快速下降至与正常对照组无显著差异。说明猪感染PRRSV后，PBMC分泌IFN-γ的能力明显增强，PRRSV可诱导猪体内效应T细胞发挥抗感染的作用[10]。本研究结果可加强对PRRSV的了解，为PRRSV的预防和诊断治疗提供一些可供分析的数据资料参考。

4 参考文献

[1] WENSVOORT G，TERPSTRA C，POL J M A，et a1.Mystery swine disease in the Net herlands：The isolation of Lelystad virus[J].Vet Microbiol，1991（13）：121-130.

[2] SNIJDER E J，MEULENBERG J M.The molecular biology of rteriviruses[J].J Gen Virol，1998（27）：4684-4691.

[3] 陈伟华.干扰现象和干扰素[J].兽医科技杂志，1980（3）：33-39.

[4] PFEFFCR L M，DINARELLO C A，HERBERMAN R B，et a1.Biologjical properties of recombinant alpha-interferons：40th anniversary of the discovery of interferons[J].Cancer Res，1998，58（12）：24898-24919.

[5] AMARA R R，IBEGBU C，VILLINGER F，et al.Studies using a viral challenge and CD8 T cell depletions on the roles of cellular and humoral immunity in the control of an SHIV-89.6P challenge in DNA/MVA-vaecinated macaques[J].Virology，2005，343（2）：246-255.

[6] CAO J，MCNEVIN J，HOHE S，et prehensive analysis of human immunodeficiency vims type l（HIV-1）-specific gamma interferon—secreting CD8*T cells in primary HIV-1 infection[J].J Virol，2003，77（12）：6867-6878.

[7] 郑霖，马玉媛，颜奇坡，等.ELISPOT检测高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒感染后猪γ-干扰素的分泌情况[J].生物技术通讯，2010， 21（5）：711-714.

[8] 郑霖.猪细胞因子检测方法的建立与初步应用[D].北京：中国人民军事医学科学院，2010.

[9] 李金明.临床酶免疫测定技术[M].北京：人民军医出版社，2005：166-178.

[10] 殷震，刘景华.动物病毒学[M].2版.北京：科学出版社，1997：204-437.