大蒜素协同草酸铂对直肠癌细胞凋亡作用的影响

【摘要】 目的 探讨大蒜素对人直肠癌SW480细胞周期的影响及其与特异性抗癌药物草酸铂联合使用的抗肿瘤作用。方法 MTT法检测大蒜素对直肠癌细胞的增殖抑制作用；流式细胞仪检测细胞周期改变；Annexin V-FITC标记法定量检测细胞凋亡；观察大蒜素与草酸铂联合使用后药物对细胞毒活性的改变。结果 大蒜素可明显抑制SW480细胞生长，大蒜素作用SW480细胞24 h后，与对照组比较，G0/G1期细胞的百分率明显减少，而G2/M期明显增加（P

【关键词】大蒜素；直肠癌SW480细胞；细胞周期；草酸铂

1 材料与方法

1．1 材料 直肠癌细胞系SW480细胞、Annexin V 细胞凋亡试剂盒由上海莱鑫仪器有限公司提供。

RPMI1640培养基和胰酶购自Gibco公司，小牛血清购自杭州四季青公司，噻唑蓝(MTT)、DMSO购自Amresco公司，96孔板购自Costar公司，碘化丙啶(PI)、RNase为Fluka公司产品。

FACScan(B.DUSA)流式细胞仪;Bio-RAD Mod-el550(B.DUSA)酶标仪。

1．2 细胞培养 将SW480细胞接种在100 ml培养瓶中，用含15%小牛血清的RPMI1640培养液， 于37℃、5%CO2的培养箱中培养，细胞贴壁80%时传代，1周传2~3次。实验用细胞为接种24 h后的对数生长期细胞。

1．3 MTT法检测大蒜素和草酸铂对直肠癌细胞SW480的抑制作用 消化收集对数生长期细胞并调整成浓度为5×104 ml的单细胞悬液，接种于96孔培养板中，24 h后加入以RPMI1640培养液配制的大蒜素，终浓度分别为80、40、20、10和5 μg/ml，同时设立含RPMI1640全培养基的空白对照组。同法配制草酸铂，终浓度分别为40、20、10、5和2．5 μg/ml。每一浓度设5个复孔，分别继续培养24、48和72 h；弃上清液后每孔加MTT 50 μl，浓度为1 mg/ml，混匀，于37℃、5%CO2 的培养箱中孵育4 h；弃上清液后每孔加150 μl的DM-SO溶解蓝紫色颗粒，以酶标仪检测波长490 nm的每孔吸光度值(A值)。实验重复2次，计算细胞抑制率。

细胞增殖抑制率=(1-实验组光密度值/对照组光密度值)×100%。采用LOGIT药物浓度抑制统计分析软件计算IC50值。

1．4 细胞周期分析 用流式细胞仪检测，取生长状态良好的细胞接种在大方瓶中，培养至密度达60%~70%时分别加入不同浓度大蒜素，设立正常对照组，培养72 h收集细胞。收集的细胞以PBS洗3次，以4℃70%乙醇固定液，1 000 r/min离心5 min，弃去乙醇，PBS洗3次后，加入10 μg/ml的RNase于37℃消化0．5 h，加入50 μg/ml的PI于4℃染色0．5 h，流式细胞仪进行DNA含量和细胞周期分析，所用软件为Cellqest。

1．5 细胞凋亡检测

以Annexin V-FITC标记法定量检测草酸铂和大蒜素联合应用时细胞凋亡的变化。将终浓度为IC50值的大蒜素和草酸铂分别加入直肠癌细胞SW480，培养72 h；另一组细胞先经浓度为1/2IC50 值的大蒜素诱导24 h后再加浓度为IC50值的草酸铂作用72 h，并设立正常对照组。细胞用0．25%胰蛋白酶消化收集，PBS清洗2次，于4℃ 2 000 r/min离心5 min，收集(1~5)×105细胞，吸取250 μl的Binding Buffer和250 μl的灭菌去离子水，混匀；用上述500 μl的Binding Buffer悬浮细胞，加1 μl Annexin V-FITC，室温下混合，加入5 μl浓度为20 mg/L的PI，避光室温反应5 min，用流式细胞仪分析(绿色荧光用FL2来检测，红色荧光用FL1来检测)。

1．6 两药联合应用72 h时草酸铂IC50值的变化

依据1．3所测的大蒜素和草酸铂抑制直肠癌SW480细胞72 h的IC50 值，一组应用终浓度为IC50值大蒜素诱导培养细胞24 h后，草酸铂再作用于SW480细胞72 h检测草酸铂IC50值的变化；另一组将IC50浓度大蒜素与草酸铂同时作用于SW480细胞检测草酸铂72 hIC50值的变化。

1．7 统计学处理

数据采用（x±s）表示，两组间均数比较采用t检验，多组均数比较采用方差分析LSD方法，所有数据采用SPSS10．0统计软件包作数据处理，P

2 结果

2．1 大蒜素和草酸铂单独应用对直肠癌细胞SW480生长的抑制作用

对照组细胞呈正常对数生长，大蒜素对SW480细胞生长有明显抑制作用，且呈时间、浓度依赖性。24 h和48 h时作用强度相对较弱，抑制率分别为3%~53%和0．68%~76%，72 h时抑制作用明显，抑制率为8．60%~93%，大蒜素抑制SW480细胞IC 50 72 h为19．55 μg/ml 。草酸铂对SW480细胞生长亦有明显的抑制作用，24 h时作用强度相对较弱，抑制率为27．36%~59．58%，48和72 h抑制率分别为22．87%~94．31%和26．69%~96．19%，草酸铂抑制SW480细胞 IC50 72 h为9．21 μg/ml 。以此为依据后面实验即以19．55和9．81 μg/ml作为大蒜素和草酸铂的浓度参数。

2．2 大蒜素对细胞周期的影响 SW480细胞在不同浓度大蒜素诱导72 h后细胞周期发生了明显变化，主要表现为G0/G1期细胞逐渐减少，同时G2/M期细胞逐渐增加，而S期细胞无明显变化。不同浓度大蒜素作用72 h对SW480细胞细胞周期的影响。

2．3 细胞凋亡率 流式细胞仪结合Annexin V-FITC标记法检测凋亡率，单独应用大蒜素19．55 μg/ml和草酸铂9．81 μg/ml作用SW480细胞72 h时，细胞凋亡率分别为82．9%和53．2%；SW480细胞先经大蒜素9．30 μg/ml诱导24 h后再加草酸铂9．21 μg/ml作用72 h，细胞凋亡率增至97．0%。结果显示大蒜素可诱导细胞凋亡，并增强草酸铂对肿瘤细胞的细胞毒活性。

2．4 大蒜素与草酸铂协同抗肿瘤作用 SW480细胞先经大蒜素(19．55 μg/ml)诱导24 h后再与草酸铂联合应用时，草酸铂72 h的IC50值由原来单独应用的9．21 μg/ml下降到1．07 μg/ml，杀伤率提高7．61倍；SW480细胞中同时加入大蒜素与草酸铂，草酸铂72 h的IC50值亦由原来单独应用的9．21 μg/ml下降到2．44 μg/ml，杀伤效率提高2．74倍，提示大蒜素与抗癌药物草酸铂联合应用，增强了草酸铂对肿瘤细胞的细胞毒活性，并提示提前应用大蒜素效果更佳。

3 讨论

肿瘤发生是一个多步骤的复杂过程，细胞的增殖分裂失调是肿瘤发生的基础。随着对凋亡研究的深入，人们认识到促进肿瘤细胞凋亡是有效治疗肿瘤的途径之一[1]。本研究采用不同浓度的大蒜素作用于人直肠癌细胞SW480后，结果显示肿瘤细胞生长受到明显抑制，大蒜素可诱导细胞凋亡。流式细胞仪检测发现S期细胞数量明显减少，细胞周期被阻滞在G2/M期。细胞周期是一个复杂有序并受严格调控的过程，细胞通过两个限制点(G1/S期和G2/M期)保证细胞的复制。细胞周期调控机制的失控，特别是G1/S期和G2/M期限制点的突变在细胞癌变过程中起着至关重要的作用[2]。G2/M期阻滞可以增加损伤DNA的修复，减少染色体畸变。本实验证实大蒜素可选择性地将细胞周期阻滞于G2/M期，保护细胞不因DNA损伤而突变产生异常增殖。大蒜素的肿瘤细胞M期阻滞作用，对临床应用大蒜素抗肿瘤，尤其与M期特异性化疗药物协同抗肿瘤有重要的理论意义。最近有研究[3]指出，在化疗药物的应用上，周期特异性药物对杀伤处于此药敏感时相的肿瘤细胞有重要意义。如果能延缓肿瘤细胞周期进程，阻止细胞从某一时相进入下一时相，导致细胞暂时性蓄积，此时如给予对这一时相具有杀伤作用的药物将能明显增效。本研究结果显示，大蒜素与抗癌药草酸铂联合使用，能明显增强其对直肠癌SW480细胞的细胞毒活性，且SW480细胞先经大蒜素处理后再加入草酸铂，其疗效更佳，此结果可能与大蒜素将直肠癌细胞SW480阻滞于G2/M期，使这一时相的细胞蓄积从而有利于增强草酸铂对肿瘤细胞的杀伤作用有关。本研究为临床应用大蒜素治疗直肠癌提供了实验依据，并提示大蒜素可作为新的非毒性调节剂，在肿瘤化疗中与其他化疗药物联合应用，以提高肿瘤细胞对药物的敏感性，增强疗效。

参考文献

1 Hino N，Higashi T，Nouso K，et al.Apoptosis and prolifera-tion of human hepatocellular carcinoma.Liver，1996，16(6)：123-129.

2 Rew D A，Wilson G D.Cell production rates in human tis-sues and tumours and their significance.Part Ⅱ：clinical data.Eur J Surg Oncol，2000，26(4)：405-417.

3 孙燕.肿瘤内科治疗的回顾和展望.国外医学肿瘤学分册，2007，27(1)：5-11.