附睾蛋白酶抑制剂基因及蛋白的研究进展

【摘要】 附睾蛋白酶抑制剂（epididymis protease inhibitor； Eppin/SPINLW1）基因在附睾和组织异性表达，存在于人类和表面，是一种编码含丰富胱氨酸残基的蛋白质的单拷贝基因。国内外研究表明Eppin在灵长类动物的生育中可能发挥重要的作用，与生殖和免疫性避孕关系密切。现对Eppin基因及蛋白的发现、特征及其在男性生殖等方面的作用做一综述。

【关键词】 Eppin； ； 男性； 不育症； 避孕； 无症

进入21世纪，人们逐渐发现人类的繁衍生育能力正在逐渐下降，不孕不育已成为继心脑血管疾病、肿瘤之后威胁全人类生存的三大疾病之一。WHO指出，排除女方的因素，婚后有规律性生活、未采取任何避孕措施的夫妻生活达到一年以上者，女方仍未能怀孕，可诊断为男性不育症。据WHO最新的统计结果显示，全球的不孕不育患者占世界人口的15%，并且这个数字还在飞速增加。我国的发病率约在12.5%左右，这些患者中约40%是由于男性因素导致的[1]。

质量是决定男性生育力最主要的方面，男性质量的下降是导致男性不育症的最重要原因，主要有少症、弱症以及畸形症[2]；另一方面，现代社会女性意外怀孕后的流产比例越来越高，目前针对男性的避孕措施仅仅局限于、体外、输精管结扎等[3]，并没有针对男性的可逆性药物，所以针对男性的避孕措施相对较少。大量研究表明Eppin（epididymal peptidase inhibitor）与生殖和免疫性避孕关系密切。本文对Eppin基因及蛋白的发现、特征及其在男性生殖等方面的作用做一综述。

1Eppin的发现及特征

研究发现部分人的精浆中存在一种蛋白质抗体，这种抗体会阻碍的液化和的运动，进而导致男性不育，后来人们将其命名为Eppin蛋白，由Eppin基因编码[4-6]。

人类Eppin表达的三种mRNA实际上只编码两种蛋白亚型（1、3的蛋白质序列一样），分别为Eppin 1和Eppin 2，它们的区别在于N端的氨基酸序列不同。Eppin 1是最主要的，它的mRNA编码133个氨基酸残基，1～21是信号肽，22～133是成熟蛋白，所以是一种分泌蛋白；Eppin蛋白理论上的等电点是8.52，相对分子质量（Mr）为15283[7]。这类蛋白质在和附睾中被检测到，可能在灵长类动物的繁衍中发挥重要的作用。

2Eppin对活动力的影响

O′Rand等[8，9]研究证实，重组Eppin免疫的雄猴无法使雌猴自然受孕，经过检测这些雄猴的血清发现其Eppin抗体阳性率非常高。王增军等[10]采用严谨的实验方法证明了存在于精浆中和表面的Eppin蛋白能够与精囊的凝固蛋白酶（Semenogelin）结合，同时让重组Eppin和重组Semenogelin的不同氨基酸片段自由结合，发现C端Eppin75-133氨基酸片段能够与Sg164-283氨基酸片段相结合，而且人类Semenogelin中唯一的胱氨酸残基（Cys239）就存在于Semenogelin片段中，这项研究证实了Eppin能够通过影响Semenogelin而发挥其作用，因此推测Eppin可能干扰了Eppin-Semenogelin结合，使形成团块影响了活动力。

ELISA法检测25例抗抗体阳性的不育患者中有7例Eppin（28%）阳性。然后使用Western blot方法进一步检测7例阳性患者的标本，发现有5例Eppin阳性表达。另外对25例可以正常生育的男性患者的进行检测，发现抗Eppin抗体均为阴性表达。这说明抗抗体阳性的不育患者的中含有抗Eppin抗体。抗Eppin抗体能够通过干扰正常Eppin和Semenogelin的相互作用，影响的成熟过程和液化情况，致使运动能力下降，进而导致患者不育。

丁新良等[11]通过对Eppin基因SNPS（单核苷酸多态性）的研究发现，位点rs2231829与数量之间以及位点rs6124715、rs11594与运动能力之间均存在显著相关性。在SNPS与发病风险的分析中，发现多态性位点rs2231829和rs11594的存在显著改变男性原发性不育症的发病风险，并且这种风险在质量异常的病例中非常明显。然而，这些SNPS各基因型对应的血清睾酮水平没有显著性差异。生物信息学分析表明，位点rs2231829影响转录因子的结合，而位点rs11594影响mRNA结构。因此可以推测Eppin基因多态性可能通过影响转录因子的结合以及mRNA的结构而影响该基因的生物学功能，进而干扰成熟过程，影响生育结局，但是这一假设还有待进一步研究证实。此外，以小鼠为研究对象，采用整体动物RNA干扰结合显微注射与膜片钳技术，发现Eppin基因低表达会引起小鼠运动能力明显下降，主要表现为平均路径速度、活力、直线速度和曲线速度的显著下降。进一步研究表明与运动能力变化相一致的是，小鼠生精细胞的T型钙电流也随之显著下降，T型钙通道的mRNA水平亦显著降低。因此可以得出以下结论：Eppin基因低表达导致生精细胞T型钙通道mRNA水平的降低和T型钙电流的下降，进而引起运动能力的下降。

3Eppin在OA和NOA诊断中的应用

基于Eppin基因在附睾和异性表达，Liu B等[18]采用Western blot的方法检测40例正常人和46例无症患者中Eppin蛋白的表达，将精浆中Eppin蛋白有表达的无症患者诊断为非梗阻性无症（NOA，Non obstructive azoospermia），而精浆中Eppin蛋白无表达的无症患者诊断为梗阻性无症（OA，Obstructive azoospermia），并且进一步通过经皮附睾穿刺术/经皮穿刺术（PESA/TESA）确诊无症的类别。对比发现，通过Western blot检测Eppin蛋白的表达得到的诊断结果与PESA/TESA的诊断结果非常类似。因此，Eppin蛋白检测或许是一种新的、有效的、无创的诊断OA和NOA的方法，将来有望在临床中得到广泛的应用。

4Eppin在男性避孕方面的应用

目前在避孕领域，男性避孕疫苗是研究的热点之一。Eppin蛋白是由和附睾特异性分泌，广泛存在于后的人类头部和尾部表面，进入附睾输出管后，表面与附睾头部和尾部所分泌的Eppin蛋白会发生特异性结合；另一方面，膜蛋白在发生和成熟过程中、受精过程中和胚胎早期发育过程中有着至关重要的作用，可能涉及到获能、顶体反应、穿透卵子透明带、精卵结合和受精卵的分裂等方面，机体可能对一些膜蛋白发生免疫反应，导致免疫性不孕症。顶体赤道区及顶体内膜含有顶体膜蛋白17（Sp17），Sp17会在顶体反应后大量表达，有促进受精的作用，其机制可能是Sp17能够与透明带上的糖基结合引起。因此Sp17和Eppin都可作为潜在的避孕疫苗靶点。

房磊臣等[19]采用基因重组及抗原抗体反应等方法，将人Sp17和Eppin作为靶抗原，成功构建了酵母Sp17-Eppin融合蛋白表达系统，获得了高纯度Sp17-Eppin融合蛋白，并且进一步在大量动物实验中发现这种融合蛋白疫苗组的避孕效应显著强于单一重组的Sp17蛋白疫苗组，大大增加了避孕效应。尽管其避孕效应具有可逆性，但同时也会造成缩小，因此对的生精功能会有一定程度的影响。然而这仍是对融合蛋白避孕疫苗构建的大胆尝试，为探索开发安全、高效、可逆的男性免疫性避孕疫苗新途径打下了坚实的实验基础。

5Eppin与糖尿病、肥胖症的关系

糖尿病、肥胖症等对男性生育力的影响正越来越受到大家的关注，它们造成的激素改变和新陈代谢紊乱会对男性生育力构成一定的危害，而且现在糖尿病和肥胖症的发病年龄越来越小，因此越来越多的人的生育力在生育年龄之前已经受到负面的影响。最近一项研究表明体重指数（BMI）对男性生育力的影响仅次于年龄。采用差异凝胶电泳方法对糖尿病患者、肥胖人群和正常人群的Eppin蛋白质组进行分析识别，对数据结果进行对比分析，证实了糖尿病患者和肥胖人群与正常人群之间的Eppin蛋白质组在表达程度上存在显著性差异[12～17]。

6结语

综上所述，Eppin基因和蛋白对质量有重要的影响，进而影响男性生育，但对其具体的分子机制报道的较少，下一步应着重对其机制方面进行研究。中抗Eppin抗体的检测或许能成为一种研究男性免疫性不育机制的无创的方法，不仅改善了不育症患者的特异性诊疗，拓宽了患者的辅助诊断指标，同时也为男性免疫性避孕疫苗的研发提供了一定的实验和临床研究基础。

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