MMP-9/TIMP-1与肝癌侵袭转移及病毒抗原表达的相关性研究

【摘要】目的：探讨基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及其抑制剂-1（TIMP-1）在人肝癌及癌旁组织中的表达和肝癌生物学行为及病毒抗原表达之间的关系。方法：应用免疫组织化学法（SP）研究40例肝癌及癌旁组织中MMP-9、TIMP-1和HBsAg、HCV抗原的表达。结果：MMP-9在肝癌和癌旁组织表达阳性率分别为70.25%和75%，癌组织明显减低（P＜0.01）。TIMP-1在肝癌组织和癌旁组织中的表达阳性率分别为57.5%和62.5%，肝癌中的表达较癌旁肝组织表达减低，但差异无显著性。转移组癌及癌旁组织MMP-9的表达显著高于无转移组（P＜0.05）；而TIMP-1则明显低于无转移组（P＜0.05）。肝癌、癌旁组织MMP-9、TIMP-1表达随着无病毒感染、单一病毒感染、双重感染分组而增高，且MMP-9表达与病毒抗原表达明显相关（P＜0.05）。HBsAg、HCV虽可在癌组织及癌旁组织表达，但有一定差异：HBsAg主要在癌旁组织表达（70%），高于癌组织表达（27.5%）；而HCV在癌组织表达（27.5%）与癌旁组织表达（30%）水平相当。结论：MMP-9、TIMP-1在肝癌及癌旁组织中的表达明显增高，可能对于判断肝癌的侵润、转移有重要价值；HBV、HCV感染可能与MMP-9表达增加有关。

【关键词】癌，肝细胞；基质金属蛋白酶-9；组织金属蛋白酶抑制剂-1；乙型肝炎抗原，丙型肝炎抗原

文章编号：1009-5519（2007）05-0649-03 中图分类号：R73 文献标识码：A

本研究检测40例肝病（HCC病人手术切除肿瘤组织、癌旁组织标本MMP-9、TIMP-1及HBsAg、HCV抗原的表达，旨在探讨MMP-9、TIMP-1在肝癌及癌旁组织中的表达和肝癌生物学行为及HBsAg、HCV抗原表达之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料：我院肝胆外科2001年1月～2005年12月手术切除原发性肝癌（PHC）标本40例，病理诊断符合2001年肝癌诊断标准[1]。男32例，女8列，年龄28～70岁，中位年龄52岁。10例正常对照组肝组织为非肝脏疾病死亡后24小时内尸解的肝脏标本。肝癌患者术前均未进行过化学及放射治疗。其中ALT高于正常者12例，AFP＞400 mg/ml者8例，肿瘤直径＜3 cm（小肝癌型）5例，3～5 cm（结节型）16例，＞5 cm（巨块型）19例；包膜完整3例，无包膜或包膜不完整37例；有转移或门静脉癌栓者10例；肿瘤高分化程度者3例，中等分化程度者34例，低分化者3例。

1.2 仪器与试剂：全自动免疫组织化学仪购自美国Lab Version公司，兔抗人MMP-9单克隆抗体、鼠抗人TIMP-1单克隆抗体、鼠抗人HBsAg单克隆抗体、鼠抗人丙肝病毒抗原单克隆抗体、SP免疫组织化学试剂盒。

1.3 方法：（1）组织标本：肝癌标本选自癌内，癌旁组织选取癌与周围正常组织交界处（与癌组织距离＜2 cm），正常肝组织取自尸解标本，经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，制备4 μm厚连续切片，贴附于涂有APES的载玻片上，烤片30分钟。（2）免疫组化学：①石蜡切片经二甲苯、梯度乙醇至水化，0.01 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗1次；②3%的H2O2浸泡10分钟，0.01 mmlo/L PBS振洗5分钟，共3次；③微波炉中高火2分钟，常温下自然冷却；④滴加正常血清，室温下10分钟，甩去多余液体不洗；⑤滴加适当稀释的第一抗体，37 ℃湿盒内1小时，PBS振洗5分钟，共3次；⑥滴加生物素化的第二抗体，37 ℃湿盒内15分钟，PBS振洗5分钟，共4次；⑦滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，37 ℃湿盒内15分钟，PBS振洗5分钟，共4次。步骤②～⑦在全自动免疫组织化学仪中进行；⑧DAB显色；⑨复染核，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。免疫组织化学实验同时做阴性对照切片（PBS代替一抗）。

1.4 结果判断：MMP-9、TIMP-1及HBsAg、HCV抗原标记均以细胞浆出现棕黄色颗粒或胞核胞浆同时呈现棕色为阳性细胞。采用双盲法，根据阳性细胞所占百分比，无明显阳性反应细胞为阴性（-），阳性细胞百分率＜25%为弱阳性（+），25%～50%为中等阳性（++），50%～57%阳性（+++），＞75%为强阳性（++++）。

1.5 统计学方法：采用卡方检验、秩和检验及行列变量的相关检验。

2 结果

2.1 MMP-9、TIMP-1在肝癌及癌旁组织的表达：MMP-9、TIMP-1在肝癌及癌旁组织的阳性率分别为70.25%（29/40）、75%（30/40）和57.5%（23/40）、62.5%(25/40)，10例正常肝组织MMP-9、TIMP-1均阴性。与正常对照组比差异有显著性(P＜0.01）。MMP-9在癌旁组织表达明显增高（P＜0.01），TIMP-1在癌及癌旁组织的分布差异无显著性（P＞0.05）。

2.2 MMP-9、TIMP-1表达与临床病理特征的关系见表1、2。转移组癌及癌旁组织MMP-9的表达显著高于无转移组，TIMP-1则明显低于无转移组（P＜0.05）。MMP-9、TIMP-1在癌及癌旁组织的表达与患者年龄、性别、血清ALT和AFP水平、肿瘤大小、分化程度、有无包膜无显著关系。

2.3 肝癌及癌旁组织中HBsAg、HCV抗原的表达：40例肝癌患者HBV总感染率为82.5%（33/40）,其中癌旁组织HBsAg阳性率为70%（26/40），癌组织阳性率为27.5%（11/40），二者比较差异有显著性（P＜0.01）；HCV总感染率为35%（14/40），其中癌旁组织HCV抗原阳性率为30%（12/40），癌组织阳性率为27.5%（11/40），二者比较差异无显著性（P＞0.05）。HBV、HCV混合感染率为32.5%(13/40)。

2.4 肝癌及癌旁组织MMP-9、TIMP-1的表达与HBsAg、HCV抗原表达的关系：将肝癌及癌旁组织中HBsAg、HCV抗原（只需癌组织及癌旁组织中有一项阳性即认为阳性）表达按无病毒感染、单一病毒感染（HBsAg阳性20例，HCV阳性1例）、乙型肝炎丙型肝炎重叠感染分为3组，与MMP-9、TIMP-1表达进行行列变量的相关检验。结果见表3。癌及癌旁组织MMP-9表达与病毒抗原表达存在相关性(P＜0.05)，而与TIMP-1无相关（P＞0.05）。

3 讨论

MMPs是一组锌离子依赖性多肽酶，目前已发现了20多种，它们共同作用几乎能降解细胞外基质的所有成分，因而成为近年来肿瘤侵袭和转移的研究重点[2]。MMP-9最主要的功能是降解和破坏细胞外基质中的Ⅳ型胶原、Ⅴ型胶原和明胶，还可通过破坏局部组织结构和基膜屏障，促进肿瘤新生血管的形成和肿瘤生长，有利于肿瘤细胞发生侵袭和转移[3]。TIMP是MMP的天然抑制剂，通过减少ECM的降解来抑制肿瘤的生长、浸润和转移[4]。本研究发现，MMP-9，TIMP-1在肝癌及癌旁组织的阳性率分别为70.25%、75和57.5%、62.5%，较正常组织明显升高；MMP-9在癌旁组织表达的阳性率显著高于癌组织，TIMP-1在癌旁表达虽然高于癌组织，但差异无显著性。MMP-9在癌及癌旁组织阳性率均高于TIMP-1，反映了在肝癌发生发展过程中，MMP-9的表达增加，超过其相对的抑制剂的表达量，使二者的表达不能完全形成1∶1的比例，结果导致MMP-9的酶活性失控，降解细胞外基质的能力增强。与以往的研究一致[4]。

本组免疫组化显示，包膜完整者癌及癌旁组织MMP-9、TIMP-1表达高于无包膜或包膜不完整者；转移者癌及癌旁组织中MMP-9阳性率明显高于无转移者，而TIMP-1的表达则显著降低。这可能是癌细胞向周围组织浸润之前，距离癌组织较近的周围组织高度表达MMP-9以降解细胞外基质、血管基膜，便于癌细胞穿越基膜屏障进入血液循环，向远处转移，并随着细胞外基质成分的降解向周围组织浸润。

本研究中，肝癌患者癌旁组织HBsAg阳性率为70%，癌组织HBsAg阳性率为27.5%，总阳性率为82.5%，明显高于HCV的检出率（35%）和HBV、HCV的混合感染率（32.5%）。HBsAg在癌组织表达较癌旁组织降低，考虑系病毒S基因发生重排或缺失以及肝细胞癌变后不利于HBsAg表达的缘故。研究显示HBV感染仍是HCC发病的首要因素，但肝癌患者中HCV的感染率也较高，提示HCV感染可能是肝细胞癌发生的原因之一；混合感染可导致肝脏病变加重，促使HCC的发生。

本研究显示癌及癌旁组织中MMP-9、TIMP-1的表达阳性率随着无病毒感染、单一病毒感染、混合感染而呈逐渐递增趋势，提示病毒感染可能诱导MMP-9、TIMP-1表达增加，但只有癌旁组织MMP-9表达在各组间差异有显著性，可能是由于癌旁组织中HBsAg和HCV的阳性率均较癌组织高，且在肿瘤细胞浸润进展过程中MMP-9表达增加在先，为一相对主动过程，超过其相对应抑制剂的表达量。

本研究还显示肝癌及癌旁组织中MMP-9的表达与HBaAg、HCV存在相关性，TIMP-1则无相关性。Chung等[4]首先发现HBV感染可使肝细胞和Hepg2细胞MMP-9的表达和活性增加，因此也增加了癌细胞的侵袭潜能。研究证实[5]，HBV感染后病毒X蛋白刺激PI-3K-AKT/PKB以及ERK1/2的活性增加，再通过EPK途径和PI-3K-AKT/PKB途径分别激活AP-1和NF-κB的转录活性，使MMP-9蛋白表达增强，进而增加肿瘤的浸润潜能；而应用U0126（ERK抑制剂）或wortmannin(PI-3K抑制剂)治疗可以显著降低由HBV x蛋白转染引起的MMP-9表达增加。本试验中单一病毒感染组以单纯HBV感染为主（HBsAg阳性20例，HCV阳性仅1例），这可能会影响到有病毒感染组MMP-9的表达阳性率，但不能完全解释肝癌及癌旁组织MMP-9、TIMP-1表达均以混合感染组最高、单一病毒感染组次之的现象，提示HCV感染对于MMP-9、TIMP-1表达均以混合感染组最高、单一病毒感染组次之的现象，提示HCV感染对于MMP-9或TIMP-1表达可能存在某种促进作用。本研究结果证明HBV、HCV感染可能促进MMP-9表达，进而增加肝癌的侵袭性。肝癌及癌旁组织中MMP-9、TIMP-1的表达明显增高，可能系肝细胞浸润转移的早期判定指标之一。

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