重组蛋白表现研讨进展

在遗传学、分子生物学、生物化学、微生物学等学科发展的基础上，20世纪70年代初出现了基因工程技术(又称重组DNA技术)。该技术通过在体外将核酸分子插入质粒、病毒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，并将其导入宿主细胞内，继而在新的遗传背景下得到稳定扩增及表达［1］。重组蛋白表达技术是研究蛋白质功能、结构，以及筛选靶向药物的有力工具，在基础科学以及医药学领域发挥了重要作用。本文对一些常见的外源基因表达系统(包括原核、真核表达系统)的优缺点进行了综述，并对其最新的研究进展进行了简要的概括，以期对我们实验过程中如何选择表达系统，提高蛋白产量有所帮助。

1原核表达系统

1.1大肠杆菌(Escherichiacoli)－典型的原核表达系统1977年，Itakura等成功地在E.coli中表达了一种哺乳动物的肽类激素－生长激素抑制素，从而首次实现了外源基因在原核细胞中的体外表达。这被认为是基因工程发展史上的一座里程碑。

1.1.1T7表达系统基于T7RNA聚合酶(T7RNApolymerase，T7RNAP)及其强启动子之间的特异性和转录的高效性建立的pET系统(No-vagen)是最常用的E.coli表达系统。T7RNAP机制在诱导蛋白表达时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白，而且表达产物产量也特别高［2］。由λpL/cI(例如InvitrogenpLEX)、Trc(例如AmershamBi-osciencespTrc)、Tac(例如AmershamBiosciencespGEX)、lac/T5(例如QiagenpQE)等启动子构成的其他原核表达体系也常用于重组蛋白的原核表达［3］。

1.1.2目的蛋白表达形式及在细胞中的定位一般来说，在E.coli中表达的外源蛋白可以分为三类:可溶性蛋白、分泌蛋白以及包涵体蛋白。(i)可溶性蛋白是目的蛋白与一段融合标签序列(FLAG、His－Tag、GFP等)融合表达而形成。这些融合标签将为进一步的蛋白浓缩、提纯、检测等提供便利，同时也可以有效的抑制宿主蛋白酶的降解活性［4－6］。(ii)采用信号肽序列可以将蛋白直接分泌到细菌的周质腔去。分泌表达可以显著降低胞内蛋白酶对蛋白的降解作用、简化蛋白纯化过程，同时有助于重组蛋白形成正确的空间结构。大肠杆菌中，已成功使用了各种不同类型的信号肽，将细胞质中表达的蛋白质转运到周质［7］。(iii)包涵体蛋白的形成是由于肽链折叠过程中，部分折叠中间态发生特异性错误聚合，不能形成成熟的天然或完全解链的蛋白所致。包涵体表达虽然可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解，但对表达产物的活性不利。因此，需要后续的溶解与复性等。

1.1.3外源基因在大肠杆菌中表达的优缺点迄今为止，E.coli作为第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，由于其遗传背景清楚、培养操作简单、转化效率高、生长繁殖快、成本低廉，且可以快速大规模地生产目的蛋白等优点而被广泛地用于外源蛋白的表达［8］。但是，作为原核表达宿主的E.coli不能产生诸如N－和O－端糖基化、脂肪酸酰化、磷酸化以及二硫键的形成等翻译后修饰。而这些修饰作用对活性蛋白的生物活性、功能、结构、溶解度、稳定性，以及半衰期等都是非常重要的。而且，E.coli表达的蛋白还会保留它们氨基末端的甲硫氨酸，这会影响到目的蛋白的稳定性，并产生免疫原性［9，10］。

1.1.4大肠杆菌表达系统的研究新进展近几年来，对大肠杆菌表达系统的研究，已经从最初的构建不同的表达载体建立新的表达系统转移为完善现有的表达系统，解决表达系统中的各种缺陷，包括:采用RosettaTM(No-vagen)代替BL21菌株来增强含有E.coli稀有密码子的重组蛋白的表达水平;采用BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS以及BL21(DE3)pLysE(Invitrogen)弥补高浓度的胞内酶环境对具有生物活性的目的蛋白在E.coli中表达的抑制等［11］。最近几年来，研究人员逐步将研究重点放在通过将一些具有活性的小蛋白与目的蛋白融合，进而促进目的蛋白在E.coli中的表达［12］，或者通过改造某种现有的表达载体，通过将各种促溶标签与载体融合，进而使得某些在E.coli中不表达的蛋白得以表达或使原本以包涵体形式表达的蛋白以可溶性形式表达［13］。这些标签包括FLAG、MBP、GST、thioredoxin等。

1.2枯草杆菌－可替代E.coli的原核表达系统枯草杆菌，学名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtili)，细胞壁不含内毒素，是一些重要工业酶制剂的生产菌。1958年，Spiz-izen等首次发现枯草杆菌168菌株能够摄取外源基因。此后，随着基因重组技术的发展，以枯草杆菌为宿主细胞的表达系统迅速发展起来。

1.2.1枯草杆菌作为外源基因表达宿主存在的优缺点作为外源基因表达的宿主，枯草杆菌有以下优势:①非致病的土壤微生物，不产生脂多糖，而脂多糖作为E.coli表达产物之一，有可能会导致人类和动物的一些神经性退行病的发生。②遗传特性强，很多噬菌体和质粒都可以作为克隆载体。③蛋白分泌能力强，有利于目的蛋白的回收和纯化。④良好的发酵基础和生产技术，枯草杆菌在工业上长期被用于生产蛋白酶、α－淀粉酶等，在相对简单的培养基中就能生长到很高的密度［14］。经过很多年的努力，许多原核和真核基因都已经在芽孢杆菌表达系统中得以克隆和表达，其中有的已应用于工业生产。但是，枯草杆菌作为产品生长菌也暴露出一些问题:蛋白酶对目的蛋白的降解、质粒的不稳定性、真白分泌量低甚至不能分泌表达等。目前，研究者已经对B.subtilis全基因序列进行测序分析，同时对源于细胞膜和质膜的蛋白酶的进行了研究［15－17］。因此，枯草杆菌作为表达宿主的这些弊端将在不久的将来得以解决。

1.2.2枯草杆菌表达系统的研究新进展与大肠杆菌相比枯草杆菌具有很强的向胞外分泌蛋白的能力，但是重组表达质粒在枯草杆菌中却不是很稳定。所以研究者一直致力于对该系统本身进行更详尽的研究上。通过寻找自然界中的这样一类枯草杆菌，它们不仅具有强分泌蛋白能力，并且没有胞外蛋白酶活性(如短芽孢杆菌)［18］，进而减少蛋白酶对蛋白的降解，促进蛋白的分泌表达。解决重组质粒不稳定的一种有效途径是将克隆基因整合到枯草杆菌的染色体上，随染色体的复制而复制［19］。

2真核表达系统

2.1酵母－最具商业价值的表达系统2.1.1几种常见的酵母表达系统酿酒酵母(S.cerevisiae)是一种单细胞真核微生物，长久以来被称为真核生物中的“大肠杆菌”，最早应用于酵母基因的克隆和表达。目前利用酿酒酵母为宿主细胞表达了多种外源基因，如乙型肝炎疫苗、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子、人血管抑制素等［20，21］。1983年，美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母(methylotrophicyeast)为代表的第二代酵母表达系统。甲基营养型酵母包括:Hansenulapolymorpha、PichiaPastoris、CandidaBodinii等［22］。以Pichiapastoris(毕赤巴斯德酵母)为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。粟酒裂殖酵母(S.pombe)是所有酵母细胞中生理特性最接近高等生物的一种，其染色体结构和功能，细胞循环的控制，RNA剪接蛋白表达分泌机制及翻译后修饰等都与哺乳动物细胞很相似。因此，在S.pombe中表达的重组蛋白有可能更接近其本来的结构和生物活性。近年来，有学者提出它可能也是潜在的能有效表达真核膜蛋白的表达系统［23］。

2.1.2酵母表达系统的优缺点酵母表达系统具有一定的蛋白质翻译后加工能力，有利于真白的表达，特有的AOX强效启动子使得外源基因表达量很高，而且酵母的培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，非常适合大规模工业化生产，另外用甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母以甲醇等工业产物代替葡萄糖作为碳源，生产成本非常低。但是酵母在表达外源基因时会造成产物蛋白的不均一、降解、信号肽加工不完全、多聚体形成等问题。而且，酿酒酵母表达蛋白时会出现蛋白切割问题、蛋白分泌效率低等问题。随着酵母基因组测序的完成及后基因组的发展，人们对酵母的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力将更加清楚，相信不久的将来，这些问题都将得到解决［24］。

2.1.3酵母表达系统的研究新进展近年来出现的酵母展示技术利用酵母细胞壁上的某些蛋白:如酵母凝集素、酵母絮凝素等，可以实现外源蛋白再酵母细胞壁上的表达。但该技术仅限于蛋白在酵母中的分泌表达，融合蛋白再分泌表达途中由于其糖基化蛋白与细胞壁的结合作用，将外源蛋白锚定在细胞壁上［25］。目前，其技术还不是很成熟，后期纯化过程并未提到。

2.2昆虫/杆状病毒表达系统－最具潜力的表达系统杆状病毒表达外源蛋白的前提要将目标蛋白编码序列克隆至合适的杆状病毒转移载体上，目的基因与杆状病毒的基因组通过同源重组制备重组病毒DNA，进而感染昆虫细胞产生重组蛋白。

2.2.1昆虫/杆状病毒表达系统的优缺点杆状病毒做为外源基因表达的宿主，由于其可以对真白进行翻译后加工等过程而被广泛地用于真核基因的体外表达。目前，已经有近千种异源蛋白在此系统中得到高效表达，而且杆状病毒还可以用于生产疫苗、基因治疗以及制备杆状病毒杀虫剂等［26］。由于昆虫是杆状病毒的自然宿主，且每种杆状病毒都只能感染一种或几种昆虫，不会感染其他动物、植物及人类，所以认为在应用杆状病毒进行研究时不需考虑其安全性问题［27］。但是，杆状病毒表达系统也存在着一定的缺陷。例如，随着感染宿主的多角体病毒的死亡，异源蛋白不能连续表达。每一轮新蛋白的合成都需要重新感染宿主细胞。此外，虽然杆状病毒表达系统能够对目的蛋白做翻译后修饰，但这种修饰存在着一定的限度;虽然其糖基化位点与在哺乳动物细胞中一样，但寡糖链的性质有所不同，无法产生复杂的糖基侧链，这可能是由于昆虫细胞不能将成熟糖链加工成哺乳动物细胞中类似的形式。

2.2.2昆虫/杆状病毒表达系统的研究新进展起初，杆状病毒系统的所用到的重组质粒都是通过同源重组的方法获得，利用杆状病毒基因组DNA与供体质粒DNA共转染昆虫细胞，这样重组病毒与原病毒混杂在一起，分离筛选效率非常低，重组效率仅为0.1%［28］。后来，研究者发现利用核多角点中的Bsu36I酶切位点将其病毒基因组线性化极大地推动了该系统发展，线性化的病毒DNA与转移质粒共转染昆虫细胞重组效率大大提高，大约为25%［29］。利用病毒杆状病毒表达系统表达外源蛋白的过程中，病毒本身也表达出蛋白酶，尤其是半光氨酸蛋白酶v－cath，会对重组蛋白进行降解。研究发现通过该在杆状病毒基因组，删除导致导致重组蛋白降解的蛋白酶基因，可以有效保证外源基因表达产物的稳定性［30］。另外，多角体启动子及其上游序列对外源蛋白的基因转录也很重要，在新开发的杆状病毒转移载体中，为提高表达效率在3’端常添加真核增强因子SV40等序列。

2.3哺乳动物细胞表达系统———一个相对成熟的真核表达系统从最开始以DNA直接转染哺乳动物细胞至今的几十余年间，哺乳动物细胞表达系统已成为多种基因工程药物的生产平台，且在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用［31］。根据表达产物用途不同，该表达系统既可以用于瞬时表达也可用于稳定表达。COS细胞常用于前者，CHO细胞用于后者。

2.3.1哺乳动物细胞表达系统的优缺点与其它真核细胞表达系统相比，目的基因在哺乳动物细胞中表达的蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎完全相同，并且在蛋白合成起始信号、加工、分泌等方面具有独特优势。但是哺乳动物表达系统成本相对较高，技术复杂，表达过程中存在着潜在的动物病毒的污染。

2.3.2哺乳动物细胞表达系统的研究新进展由于哺乳动物细胞表达蛋白的成本较高，因此如果蛋白能够在胞外分泌表达，这样就会大大降低生产成本，有利于实现重组蛋白在哺乳动物细胞表达的工业化生产。为了方便蛋白大量生产以及后期纯化，研究者通常会选择在载体或者目的片段上添加信号肽序列，这样可以增强蛋白的胞外分泌能力。王洪亮等通过在载体上添加CD5L引导肽序列，使得重组蛋白在哺乳动物细胞中得到很好的表达［32］。

2.4其他真核表达系统———一些新兴的表达系统随着分子生物学技术的发展，人们对重组蛋白表达的研究也逐步深入，近些年来，除了上述一些常规的表达系统，研究者又逐步发现了一些新兴的表达系统，这些表达系统主要包括植物和动物细胞/组织表达系统。

2.4.1转基因动物表达系统利用现代分子生物学技术，我们可以将重组DNA导入到受精卵的细胞核去。这些DNA复合物通过一定的频率整合到宿主基因组中，依赖于不同的启动子，在机体的各组织和器官得到表达。到目前为止，已经有不少的转基因动物用于重组蛋白的生产［33－35］。在各种器官和细胞中，乳腺组织可以进行大规模的翻译后修饰，并具有良好的渗透屏障。因而，为大多数研究蛋白质生产的研究人员选择作为定位器官来表达外源蛋白。近年来，转基因动物乳腺生物反应器的研究已经成为生物工程领域研究的热点，一般用来高效、高质量生产具有生物活性的蛋白。但多数研究表明，乳腺特异性表达的成功率很低，蛋白在乳汁中的表达水平较低［36］。除了动物的乳腺组织，母鸡的蛋清在也可以作为一种低廉、高效的生物反应器用于人类的制药行业。但是目前为止，还没有相应的商业化产品，这可能是由于转基因鸟类还难以实现的原因［37］。

2.4.2转基因植物表达系统外源基因可以使用带有分泌信号肽序列的植物体使重组蛋白分泌表达。利用植物做为生物反应器生产的重组蛋白在折叠和组装上与动物细胞更为相似，从而具有与高等动物细胞表达的产物基本一致的免疫原性和生物活性，并且不会存在被动物、病原体污染的可能性。但是，植物表达系统还处于发展阶段，也存在着外源蛋白表达量低等问题［38］。3讨论本文介绍了几种常用的重组蛋白表达系统，并对各自优缺点及最新的而研究进展进行了相应的概括。随着我们对基因表达调控机制的深入研究，及其在生物技术领域的发展，所有的表达系统都可以在功能上有进一步的改善，同时我们也期待更多的新的表达系统的产生。但是，一些表达系统本身固有的缺陷也不能忽略。因此我们在选择表达系统时，应该综合考虑这些因素以及表达产物的生物学特性及用途等。例如，真核表达系统是表达生物活性蛋白及疫苗的理想选择。相反，原核表达系统可以提供足够的人工抗原用于诊断或不需要翻译后修饰的蛋白的结构分析。因此，选择表达系统时，必须充分考虑各种因素，如所需要表达的蛋白是否有毒性，是否有活性，是否需要糖基化，还需要考虑成本、产量及纯化路线和安全性，权衡利弊后在研究工作积累和实践探索的基础上，做出谨慎的判断和选择。最后，表1和表2总结了常用的各表达系统的特点及应用。