等温核酸扩增技术进展

【摘要】 等温核酸扩增技术已广泛应用于生物分析的体外核酸扩增，本文综合国内外报道，对等温核酸扩增技术的进展进行简要综述，包括依赖核酸序列型扩增（NASBA）、链置换扩增（SDA）、滚环扩增（RCA）、环介导等温扩增（LAMP）、单引物等温扩增（SPIA）、交叉引物等温扩增（CPA）、新型等温多自配引发扩增（IMSA）的原理、重要特性、应用及未来的展望。

【关键词】 等温核酸扩增； 依赖核酸序列型扩增； 链置换扩增； 环介导等温扩增； 新型等温多自配引发扩增

Progress of Isothermal Nucleic Acid Amplification Techniques/LIANG Hai-yan，LIU Wen-xin，YANG Zhi-gang.//Medical Innovation of China，2017，14（16）：145-148

【Abstract】 Isothermal nucleic acid amplification techniques have been widely used in vitro nucleic acid amplification for bioanalysis.This paper gives a brief review of isothermal nucleic acid amplification technologies such as NASBA，SDA，RCA，LAMP，SPIA，CPA and IMSA.Starting off from their amplification mechanisms and significant properties，the application in bioanalytical chemistry and their future perspectives are discussed.

【Key words】 Isothermal nucleic acid amplification； NASBA； SDA； LAMP； IMSA

First-author’s address：Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Zhanjiang 524001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.16.042

核酸基于其生物特性被用来作为生物研究和医疗诊断的重要生物标志物。聚合酶链式反应（PCR）是第一个也是最受欢迎的用于扩增及低丰度检测核酸扩增技术。尽管PCR技术被广泛地应用到各个领域，但他需要反复的热循环及精密仪器的缺点限制了其在资源有限或实地分析中的应用。近年来出现及迅猛发展的等温核酸扩增技术有望成为未来发展的新趋势，因为其只需恒温装置（例如：水浴锅），便能进行快速且高效的扩增反应。从20世纪90年代始，很多等温核酸扩增技术被发展起来，多种等温扩增方法都具有高灵敏度，而且有部分技术已成功转向商业化[1]。在众多的等温扩增技术中，环介导等温扩增技术应用范围较为广泛，其他的等温扩增技术还有依赖核酸序列型等温扩增、链置换等温扩增、滚环等温扩增、单引物等温扩增、交叉引物等温扩增。本文综述了这些等温扩增技术及其在分子诊断的应用，并探讨等温扩增技术的发展及前景。

2 等温核酸扩增技术

2.1 依赖核酸序列型扩增技术 依赖核酸序列型扩增技术（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）[2]，是一种基于转录依赖扩增系统建立起来的等温扩增技术。NASBA通过模拟逆转录病毒复制方式设计而成，用于扩增单链RNA序列。NASBA的基本原理是模板RNA被反义引物识别，并在逆转录酶的RNA依赖型DNA聚合酶活性作用下形成互补DNA链，而RNA-DNA复合体被核糖核酸酶H（RNase H）处理，使得原来的RNA链被降解，接着在逆转录酶的DNA依赖型DNA聚合酶活性作用下，含T7启动子的特异引物（oligdNTP）识别新合成的单链DNA链，形成含T7启动子的双链DNA结构，该结构可作为随后循环扩增的底物。T7RNA聚合酶能够使带T7启动子的DNA链作为模板合成与原来RNA链序列相似的新的RNA链。

通常NABSA能在41℃条件下进行，经过1.5～2 h的扩增可将模板RNA放大至109倍，灵敏度与RT-PCR的相当。NABSA的终产物可用凝胶电泳、实时荧光法、比色法及电化学发光法检测，FDA已批准使用NASBA技术在HCV和HIV-1等一些微生物的分子检测[3-4]。

2.2 链置换扩增技术 链置换扩增技术（strand displacement amplification， SDA）在1992年首次由Walker等提出，cNABSA不同的是，SDA是依靠酶促反应进行的DNA体外核酸等温扩增。其扩增过程需要经过DNA单链模板的准备、5’端3’端均含酶切位点的目的DN段的生成和链置换反应三个阶段。理论上，SDA在37～40 ℃进行23次循环后，2 h内靶序列可得到108扩增[5]。

在SDA产物检测上Walker等将荧光技术与SDA结合，建立了SDA的荧光偏振（Fluorescence polarization，FP）检测方法。Spears等[6]将荧光探针加入到SDA的循环阶段，建立了同步SDA荧光偏振（simultaneous SDA and FP detection）检测技术，并成功应用于沙眼衣原体检测。有关学者将SDA与压电DNA传感器技术相结合，研制了SDA压电DNA传感器，并对33份临床样本进行铜绿假单胞菌检测，其结果与荧光定量PCR结果一致，且更快速、灵敏。SDA技术也用于病毒RNA的检测，如Mehrpouyan等[7]用SDA技术建立了对HIV-1病毒的检测，SDA技术在结核病、基因诊断等方面也已有报道[8]。

3 展望

伴S着高效的扩增，等温核酸扩增技术可以作为便携式分子诊断发展的理想候选技术。在过去的20年里，等温核酸扩增技术有着显著的进步。尽管目前PCR仍然是用于核酸扩增最为广泛的技术，但由于其需要热循环扩增仪及复杂的扩增程序，这些不足造成PCR实地应用困难并导致筛查成本的增加。相比之下，等温扩增技术对于原始生物样本的应用范围更宽，在临床诊断的效能上两者相当或者说等温扩增技术更优于PCR技术。等温扩增技术的优点还有，从样本的处理到后续的检测，等温扩增技术只需在一个小管里便可进行，以及其检测只需微量样本、检测快速。

一些等温扩增技术已被发展成为商业产品，如NASBA、SDA、LAMP、SPIA等。尽管等温扩增技术已经被证实应用于分子诊断上以及被商品化了，但其广泛应用，尤其是商业产品的广泛使用却未实现，这其中最大的障碍并非缺乏适当的等温扩增技术，而是其具体技术细节的复杂性和成熟度（包括专利保护和推广应用之间的矛盾问题）。因此，在未来生物分析体系的发展里，等温核酸扩增技术有着重大的机遇。总的来说，鉴于其简便性、高效能扩增以及小型化及自动化的高度适应性这些优势，等温核酸扩增技术在不久的将来会在分子诊断方面普及应用，尤其是在床旁及实地筛查检测的应用。

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