担子菌纤维素酶的分离与纯化

摘要:本实验以高产纤维素酶担子菌LKY01发酵液出发分离获得纤维素酶。将担子菌七天发酵液收集后,经30%-80%硫酸铵分级沉淀、0.45mm滤膜过滤、10kd截留超滤管超滤除盐浓缩,得浓缩酶液。将浓缩酶液上DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱,进行梯度线性洗脱。合并酶活最高主峰洗脱液,浓缩后上Superdex 75凝胶层析柱,得到的两个酶活蛋白组分,FPA酶和CMC酶。经测酶活及电泳实验分析,所得FPA酶和CMC酶分子量分别为36.2和34.6,纯化倍数分别为26.86倍和24.42倍。

关键字:担子菌;纤维素酶;分离纯化

中图分类号:Q814.1 文献标识码:A

文章编号:1674-0432(2010)-05-0030-2

国内外对纤维素酶纯化研究主要集中于木霉和嗜热毛壳菌等微生物所产纤维素酶的纯化,对担子菌纤维素酶纯化研究较少。国家粮食局科学研究院唐芳等筛选到高产纤维素担子菌LKY01菌株。本实验将此菌产纤维素酶进一步分离纯化。纯化担子菌LKY01纤维素酶属于外分泌蛋白,将担子菌LKY01纤维素酶纯化后用于食品业、饲料业、制药业相对其他菌种所产纤维素酶安全性较高。纤维素酶是一组相互协作的酶系,菌种来源不同,酶系组成亦不同;真菌纤维素酶为糖蛋白,且具有多型性,这些特点使得纤维素酶在分离纯化过程中难度增大。国内外多采取硫酸铵沉淀法得到粗酶液,也有少数使用双水相萃取技术和微晶纤维素亲和技术对纤维素酶进行初步分离,国内也有报道采用超临界萃取法提取纤维素酶。本实验使用硫酸铵分级沉淀法获得粗酶液。在除盐过程中,为避免透析袋被纤维素酶降解,本实验采用超滤法除盐,较常用的透析法方便省时。

一、材料与方法

(一)材料

1.菌种:本实验室筛选高产纤维素酶担子菌菌种LKY01。

2.纯化仪器:AKTAbasic层析系统产于Amersham公司。

(二)方法

1.纤维素酶的纯化方法。

(1)粗酶液的制备。自筛菌株液体发酵培养7d,然后将酶液用两层纱布过滤后收集,4℃,5000r/min,离心10min。所得上清液即为粗酶液。

(2)硫酸铵分级沉淀将所提取的粗酶液加入固体硫酸铵至30%饱和度,室温磁力搅拌2h,5000r/min,离心10min,收集上清;将上清收集液再加入固体硫酸铵至80%饱和度,4℃静置过夜,5000r/min离心10min,收集沉淀,用适量的缓冲液A(50mmol/LTris-Hcl缓冲液,pH值8.0)将沉淀蛋白溶解。

(3)超滤除盐浓缩。上述的硫酸铵盐析的蛋白回溶液,经0.45mm滤膜过滤后用截留分子量为10KD的超滤离心管脱盐浓缩,5000r/min,离心20min后,加缓冲液A稀释后再离心脱盐,重复3次。

(4)DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子柱层析。将超滤浓缩的蛋白溶液上样于经缓冲液A平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子柱(1.6×26cm),酶蛋白先用5倍柱床体积的缓冲液溶液A洗脱至A280不变后,再用缓冲液A和含1mol/L NaCl的相同缓冲液进行梯度洗脱。将每管进行活性测定,收集所有出峰的酶液。

(5)Superdex-75分子筛层析 将离子交换层析后收集的酶液超滤浓缩,施于经缓冲液A平衡好的Superdex-75分子筛层析柱(1.6×62cm),用缓冲液A洗脱,流速为0.3mL/min,2.5min收集1管,将每管进行活性测定。

2.检测方法。

(1)酶活测定。羧甲基纤维素酶活力(CMC)测定 取0.5mL酶稀释液,于25mL刻度试管中,加入0.5mL 2%的CMC溶液(溶于pH4.80.10mol/L 柠檬酸缓冲液),摇匀,于50℃恒温水浴反应30min,加入3.0mL DNS溶液,沸水浴5min,冷却后,定容至25mL,于540nm波长比色。

滤纸酶活力(FPA)测定 取0.5ml酶稀释液,于25mL刻度试管中,加入1.0mL 0.10mol/L 柠檬酸缓冲液(pH4.8),再加入折叠的Whatman No.1纸1张(6cm×1cm,约50mg),于50℃恒温水浴反应60min,加入3.0mL DNS溶液,沸水浴5min,冷却后,定容至25ml,在540nm波长比色。酶活力单位定义:在规定的实验条件下,1.0mL酶液 30min酶解底物产生1μmol还原糖为一个国际单位(IU)。

(2)蛋白质含量测定蛋白质含量测定参照Bradford的方法(1976),以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白。

(3)蛋白质纯度鉴定采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定蛋白质纯度。参照Michaud的方法(1993)

(4)蛋白质分子量的测定SDS-PAGE法测定蛋白质分子量参照Michaud等的方法(1993),结果用UVBand处理系统分析。

二、结果

(一)硫酸铵分级沉淀

30%硫酸铵盐析后,离心上清液FPA酶比活力为0.33U/mg提纯倍数为2.20倍,CMC酶比活力为2.71U/mg提纯倍数为1.46倍。80%硫酸铵盐析后,离心沉淀回溶液FPA酶比活力为0.27U/mg提纯倍数为1.80倍,CMC酶比活力为2.31U/mg提纯倍数为1.24倍。此过程中硫酸铵盐对酶活测值有很大影响。

(二)超滤除盐浓缩

上述的硫酸铵盐析的蛋白回溶液,经0.45mm滤膜过滤后用截留分子量为10KD的超滤离心管脱盐浓缩,总体积由173ml浓缩至151ml。

(三)DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析

在离子交换层析结果中出现3个平衡峰和5个洗脱峰,收集各峰测酶活,从洗脱液中选出酶活相对高的洗脱峰峰3各管做电泳。离子交换层析法分离担子菌发酵液并不能将其中各种酶完全分开,但各峰中含蛋白种类减少。洗脱峰峰3对应的电泳条带相对少,酶活相对高,因此将洗脱峰峰3定为下一步分离的目标峰。此过程中洗脱峰峰3的FPA酶比活力为2.03U/mg提纯倍数为13.56倍,CMC酶比活力为13.47U/mg提纯倍数为7.24倍。

(四)Superdex75凝胶层析

DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析后,将蛋白峰3各管收集,合并浓缩至约0.5mL后进行分子筛层析。Superdex 75凝胶层析检测结果有2个主要蛋白峰。将收集液分别测定酶活和电泳蛋白纯度鉴定,FPA酶和CMC酶活主要集中在峰2中。电泳中两个蛋白其分子量分别为36.2kd和34.6kd。由于主峰2中两各蛋白分子量接近,很难在凝胶层析中分开,SDS-PAGE中可以很好的分开。此过程中峰3的FPA酶比活力为4.03U/mg提纯倍数为26.86倍,CMC酶比活力为45.43U/mg提纯倍数为24.42倍。

(五)纤维素酶的各纯化步骤结果

三、结论

本实验将担子菌LKY01 7天发酵液经硫酸铵分级沉淀,0.45mm滤膜过滤,超滤管超滤除盐,DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱分离,Superdex 75分子筛层析再次分离,得到一定纯化程度的纤维素酶,FPA酶和CMC酶的纯化倍数为26.86倍和24.42倍,经测酶活及电泳实验分析,FPA酶和CMC酶分子量为36.2kd和34.6kd。两种酶属于新酶,未见国内外报道。

参考文献

[1]You-Jung Lee,Bo-Kyung Kim,Bo-Hwa Lee,Kang-Ik Jo,Nam-Kyu Lee.PuriWcation and characterization of cellulase produced by Bacillus amyoliquefaciens DL-3 utilizing rice hull [J].Bioresource Technology.2008,99:378386.

[2]Xiao Ping Huang and Colin Monk .Purification and characterization of a cellulase (CMCase) from a newly isolated thermophilic aerobic bacterium Caldibacillus cellulovorans gen.nov.,sp.nov[J].World Journal of Microbiology & Biotechnology.2004,20:8592.

[3]radford M.A rapid and sensitive assay of protein utilizing the principle of dye binding [J].Analytical Biochemistry.1976,72:248-254.

[4]Michaud D,Faye L,Yelle S.Electophoretic analysis of plant cysteine and serine proteinases using gelatin-containing polyacrylamide gels and classspecific proteinase inhibiors [J].Electophoresis.1993,14:94-98.

作者简介:刘家英(1982-),女,吉林农业大学生命科学学院硕士研究生,研究方向:免疫生物化学;张林波(1973-),男,吉林农业大学生命科学学院副教授,医学博士,研究方向:免疫学。

通讯作者:*唐芳(1978-),女,吉林白城人,就职于国家粮食局科学研究院,助理研究员,研究方向:粮食微生物。