ephrinA3系统在海马EphA4

摘要：目的 观察海马

EphA4 ________________________________________

ephrinA3的分布特点及在缺血/再灌注过程中的动态变化规律，了解EphA4

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ephrinA3对在海马CA1区神经元迟发性死亡中影响。方法 采用经典的四血管夹闭短暂前脑缺血/再灌注模型，通过TUNEL染色观察缺血/再灌注后6 h、24 h、48 h各组海马神经元凋亡情况，同时检测Caspase 3的活性，并以western blot检测EphA4及ephrin A3蛋白表达的变化。结果 短暂前脑缺血/再灌注可以引起海马CA1区神经元迟发性死亡。Caspase 3活性在缺血/再灌注后明显升高，再灌注6 h、24 h、48 h(OD值分别为2.30±0.19，2.20±0.28，1.90±0.015)与sham组(OD值为1.100±0.017)比较有统计学意义(P

关键词:缺血/再灌注； EphA4受体；ephrinA3；海马；凋亡

中图分类号：R741 R85.5 文献标识码：A 文章编号：1672

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1349（2011）09

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建立短暂前脑缺血/再灌注模型，观察海马（EphA4

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ephrinA3）的分布特点及在缺血/再灌注过程中的动态变化规律，同时进行神经元凋亡的相关检测，以期明确EphA4在神经元迟发性死亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠，体重180 g~240 g，随机分为两组。伪手术对照组，缺血/再灌注组(缺血15 min，再灌注6 h、24 h、48 h)，每组6只。

1.2 大鼠前脑缺血/再灌注模型的建立 采用改良的Pulsinelli四血管夹闭方法进行短暂前脑缺血。行升主动脉灌注固定以进行TUNEL染色，麻醉后断头提取新鲜大脑海马组织，并分离海马组织的上半部，主要为CA1区，以及下半部，主要为CA3区，保存于-80℃,以进行Caspase 3活性的测定。伪手术(sham)组先行灼闭双侧椎动脉，次日打开颈部切口但不夹闭颈动脉造成缺血，余处理同缺血/再灌注组。

1.3 海马组织神经元TUNEL染色 利用In Situ Cell Death Detection试剂盒（Promega公司）进行检测。应用BI2000医学图像分析系统进行拍照分析。计数海马锥体神经元中阳性细胞所占的百分比。

1.4 海马组织Caspase 3活性分析 提取海马组织样品，冰浴中匀浆，离心取上清。按试剂盒说明测定蛋白浓度及Caspase

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3活性。结果以比活性反应海马组织中Caspase

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3的活性。

1.5 Western blot测定EphA4和ephrinA3的蛋白表达 利用SDS

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PAGE电泳技术分离匀浆组织中的蛋白，再转移至硝酸纤维素膜。用EphA4,ephrinA3单克隆抗体(Santa Cruze,Inc)，免疫印迹检测脑组织EphA4,ephrin A3含量。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13．0软件分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析及t检验。

2 结 果

2.1 短暂脑缺血/再灌注对海马CA1区神经元迟发性死亡的影响 至缺血/再灌注后7 d，CA1区细胞带消失，提示CA1区神经元大量死亡。脑缺血/再灌注７ d组，显示CA1区广泛锥体神经元死亡，而CA3和齿状回细胞无明显变化。

2.2 海马CA1区Caspase 3活性增高及神经元凋亡增加 Caspase 3活性在缺血/再灌注后6 h即有升高，6 h、24 h、48 h OD值分别为2.30±0.19，2.20±0.28，1.900±0.015，与sham组(OD值为1.100±0.017)比较有统计学意义(P

2.3 CA1区ephrinA3与EphA4蛋白表达 与对照组相比，海马缺血/再灌注后6 h海马CA1区组织中ephrin A3的含量显著增高，IOD值为2.05±0.12 vs 0.78±0.02（P

3 讨 论

海马脑区在学习记忆中具有重要作用，但其对缺血损伤极为敏感，尤以CA1区为著。在缺血/再灌注过程中，海马神经元受到多种因素的损伤刺激后，如兴奋性神经毒素、氧化应激、炎症，而发生死亡。在缺血后极短的时间内，由于能量供应急剧减少，依赖ATP的各种功能障碍很快出现，首先表现为离子梯度的改变，膜的去极化，以及细胞外谷氨酸及其他神经递质的升高［1］，继之以胞内钙的升高，启动了细胞死亡过程［2,3］。如果缺血过程较为短暂，则细胞死亡主要表现为迟发性的神经元死亡［4］。

海马区酪氨酸激酶受体

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配体(Eph

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ephrin)在星形胶质细胞与神经元的相互作用中扮演了重要的角色。Eph及ephrin均为膜蛋白，通过Eph向细胞内传递的信号称为正向信号，通过

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1） 为2010年教育部留学回国人员科研启动基金、教育部科学技术研究重点项目、山西省回国留学人员基金（No.200949）、山西医科大学细胞生理学省部共建教育部重点实验室主任基金资助项目（No.201004）其配体ephrin 的信号称为反向信号。它们参与正常组织中血管生成、组织边界形成、细胞迁移、轴突导向和塑型以及骨稳态调节等［5,6］。

ephrinA3 是成年海马区最为丰富的ephrin

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A配体。ephrinA3标记主要位于 GFAP阳性星形胶质细胞上。在脑中，星形胶质细胞ephrinA3与神经元EphA4之间的相互作用可调节突触后神经元形态［7,8］

本研究发现，在缺血/再灌注后，海马CA1区神经元发生迟发性死亡，TUNEL染色可见有大量凋亡神经元，而Caspase 3的活性在CA1也有显著增高。在CA1区锥体神经元，再灌注后caspase 3的过表达与锥体神经元DNA断裂及迟发性死亡是密切相关的。在单纯缺血/再灌注组caspase 3活性升高。同时在再灌注后6 h，海马CA1区ephrinA3即有显著升高，之后逐渐下降，这种缺血诱导的ephrinA3表达增高与Pulkkinen等在局灶性脑缺血中观察到的结果一致，即缺血可以诱导海马区ephrinA3的表达。对照侧海马 CA3区也有表达，但较缺血侧明显较低，且表达方式也不同［9］ 。EphA4在反应性星形胶质细胞也有表达［10,11］。本研究观察到EphA4在缺血/再灌注后的海马CA1区也有升高，这表明ephrinA3/EphA4可能参与了缺血后的病理过程，推测与以下一些因素有关。首先，ephrinA3与EphA4的上调通过对突触间隙谷氨酸浓度调节，影响了缺血/再灌注后的兴奋毒效应。前脑缺血可引起大鼠或沙土鼠海马谷氨酸转运体（glutamate transporter 1， GLT

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1）表达减少，以及功能减弱，但不影响GLAST（glutamate

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aspartate transporters）的表达，这一现象先于神经元迟发性死亡发生。而GLT

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1主要由星形胶质细胞表达［12

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15］。有研究发现星形胶质细胞上过表达ephrinA3可降低胶质细胞上谷氨酸转运体数量，由此可调节突触谷氨酸浓度及突触后去极化，调节LTP［16］。EphA4与ephrinA3相互作用，可以下调谷氨酸转运体及减少谷氨酸摄取，ephrinA3的反向信号也可以抑制谷氨酸转运体。研究者以EphA2 Fc(只与ephrin

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A 结合。EphA4还可与ephrin

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B2结合)来结合ephrinA3，在野生型大鼠引起显著的谷氨酸摄取下降，同时引起GLT

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1 与 GLAST水平下降［17］。

在脑缺血/再灌注过程中，兴奋毒是神经元重要的损伤机制，EphA4与ephrinA3的表达上调，并且，有研究表明二者的结合可抑制谷氨酸摄取。星形胶质细胞是突触间隙谷氨酸浓度的重要调控者，缺血/再灌注中其ephrinA3表达的上调可造成谷氨酸转运体的数量及功能的下降，其对于兴奋毒的加剧可能起了推波助澜的作用。

本研究发现，短暂脑缺血/再灌注可诱导海马CA1区ephrinA3与EphA4的表达明显增高，其时间过程与Caspase增高的时间过程一致，这可能是CA1细胞对脑缺血易损的一个重要机制。

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作者简介：刘乃红（1973―），女，山西医科大学在读博士研究生，现工作于太原科技大学（邮编：030024）；王锐、 王晔，现为山西医科大学生理教研室在读硕士；李建国（通讯作者）、 张策（通讯作者），工作于山西医科大学（邮编： 030001）。

(收稿日期：2011

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