小鼠胚胎冷冻保存条件探究

摘要：为探索在实验室条件下最佳的小鼠胚胎冷冻保存条件。对不同发育阶段小鼠胚胎按照同一个冷冻程序进行冷冻;两个不同的冷冻程序对同一个发育阶段的小鼠胚胎进行冷冻。结果表明，-7 ℃平衡10 min，然后以0.3 ℃/min的速率迅速降至-35℃，-35 ℃平衡5 min后投入液氮中，此冷冻程序比较适合小鼠胚胎冷冻;冷冻保存对16细胞以上的小鼠胚胎影响较小。

关键词：小鼠;胚胎;冷冻保存

中图分类号：Q954.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）20-4915-02

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2014.20.037

Cryopreservation Conditions for Mouse Embryo

ZHANG Li-ping1，CAO Hui2，LIU Xi-mei1，BI Yan-zhen1，XIAO Hong-wei1，LI Li1，HUA Zai-dong1，HUA Wen-jun1

（1.Institute of Animal and Veterinary Science/ Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding， Hubei Academy of Agriculture Sciences，Wuhan 430064，China; 2.Pulike Biological Engineering Inc.， Luoyang 471000， Henan， China）

Abstract： The optimal cryopreservation conditions of growth stage and cryopreservation process for mouse embryo were investigated. The results showed that the optimal program was putting the embry into -7 ℃ for 10 min， then cooling rate to -35℃ with -0.3 ℃/min， after holding for 5 min， putting it into liquid nitrogen for cryopreservation. It had a small effect on the embryos with more than 16-cell.

Key words： mouse; embryo; cryopreservation

小鼠胚胎冷冻体外受精胚胎移植自1972年Whittingham等[1]首次用液氮冷冻保存小鼠胚胎成功后，哺乳动物胚胎冷冻保存技术取得了飞跃的进展，在畜牧业和实验动物种质保存中发挥了巨大的作用。随着遗传工程小鼠的大量出现，建立一种常规的安全可靠的胚胎冷冻方法保存这些极其珍贵的遗传资源至关重要。本试验对影响小鼠受精胚胎冷冻因素进行了对比，旨在寻找在本实验室条件下最佳的小鼠胚胎冷冻条件，建立一种适合于本实验室的无需专业实验室人员即可操作的快速简便的动物胚胎冷冻方法，从而用于指导实践。

1 材料与方法

1.1 小鼠胚胎的获取

6～10周龄昆明白雌鼠控光（14 h光照，10 h黑暗）饲养1～2周后，腹腔注射10 IU/支PMSG（宁波激素制品厂）46～48 h腹腔注射10 IU/支hCG（宁波激素制品厂）进行超排。注射hCG后与雄鼠合笼，次日早晨检查阴道栓。

见栓雌鼠分别于注射hCG后52～54 h、65～66 h和77 ～78 h处死，采集4-cell、8-cell和16-cell以上细胞。

1.2 胚胎冷冻

冷冻液为从乙二醇（Ethylene glycol，EG）冷冻液（直接从北京市谭河科技开发中心购买，货号TH044）。先将胚胎移入已经预热过的EG中室温平衡5 min，再装入0.25 mL的塑料细管中，每管2～5个胚胎。将装有胚胎的塑料细管放入冷冻仪（planer，英国）中，按照试验设计的程序运行。运行完毕后，迅速投入液氮罐中保存。

1.3 胚胎解冻

胚胎冷冻保存1周后解冻。自液氮罐中取出塑料细管，室温下于空气中停留数秒后置入盛有32 ℃水浴的烧杯中，停留数秒。取出细管，将解冻后的胚胎推入平皿中，再移入已经预热的M16，用M16洗3次以便彻底去除EG。

1.4 胚胎培养

培养液为M16（Sigma），提前2 h将M16做50 μL微滴并覆盖石蜡油，放入CO2培养箱中平衡。将解冻胚胎移入培养微滴中，10～15枚/滴，放入37.5 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱内进行培养并记录发育率和囊胚发育率。

1.5 胚胎细胞计数

将胚胎移入含10 μg/mL的Hoechst33342的M2中处理10 min，后在荧光显微镜下观察，记录胚胎细胞数。

1.6 试验设计

1）对不同发育阶段（4-cell、8-cell、16-cell以上）小鼠胚胎按照同一个冷冻程序进行冷冻，解冻后比较3个发育阶段小鼠胚胎的发育率和囊胚率。

2）采用两个不同的冷冻程序对同一个发育阶段的小鼠胚胎进行冷冻，程序1：-7 ℃平衡10 min，然后以0.3 ℃/min的速率迅速降至-35 ℃，-35 ℃平衡5 min后投入液氮中;程序2：5℃平衡5 min，后以0.2 ℃/min的速率降至-7 ℃，-7 ℃平衡5 min，以0.5 ℃/min速率降至-30 ℃，-30 ℃平衡5 min后投入液氮中。解冻后比较两个冷冻程序对同一个发育阶段小鼠胚胎的影响。

2 结果与分析

2.1 冷冻对不同发育阶段小鼠胚胎的影响

从表1可以看出，冷冻对不同发育阶段小鼠胚胎的影响有明显差异（P

2.2 冷冻程序对小鼠胚胎的影响

从表2可以看出，冷冻程序对小鼠胚胎冷冻后影响显著（p

3 讨论

胚胎冷冻是长期保存动物种质资源的一项实用技术。胚胎冷冻技术的发展和应用减少了时间和空间对胚胎操作造成的限制，并可有效避免因家畜的活体运输所造成的疾病传播。以前，小鼠和人的冷冻胚胎常用PG作为保护剂，但是最近研究证明，EG毒性较小[2-4]，并且已广泛用于动物胚胎的慢速和玻璃化冷冻[5]。本试验采用牛胚胎的冷冻程序[6]，同时将其冷冻和解冻程序进行简化后对小鼠不同发育阶段（4-cell、8-cell及16-cell以上）的胚胎进行了冷冻，解冻后发现，4-cell和8-cell胚胎有部分胚胎的透明带已经完全破损，虽然有的胚胎透明带完好，但是细胞质出现微小的颗粒，并且细胞间距和卵周隙增大，分析可能因为4-cell和8-cell胚胎放入冷冻液后卵裂球因脱水收缩造成;16-cell以上不出现透明带破损现象，去除冷冻液后，胚胎也可以恢复到冷冻前状态，但是细胞质内同样出现微小颗粒，与罗明久等[7]的结果相同。经培养后，16-cell以上的胚胎囊赔率可以达到62.5%，低于孙艳香等[8]报道的冻后发育率（91%），但是远远高于4-cell（0%）和8-cell（45.5%），此结果与Tao等[9]相同。

1972年Whittingham等[1]建立了缓慢冷冻法，并且第一次报道小鼠胚胎冷冻获得成功，将胚胎置于冷冻保护剂中，利用程序冷冻仪或不同温差的冰箱分阶段降温。在胚胎冻存的四个阶段中：①从室温降至诱发结晶温度;②诱发结晶（Seeding）;③慢速（0.3 ℃ ～0.5 ℃/min）冷冻至一个中间温度（-30 ℃ ～-35 ℃）;④快速冷冻至液氮温度（-196 ℃）。目前，胚胎的体外成熟培养技术日趋成熟，体外生产（IVP）的胚胎低温保存已经取得成功[10]。随着冷冻技术的不断进步，经过数十年的发展，现已建立了许多冷冻保存的方法，常用的有常规的缓慢冷冻法、玻璃化冷冻法和开放式拉管法等。本试验对小鼠胚胎进行了程序化冷冻条件的探索，结果发现，不同的冷冻程序对小鼠胚胎的损伤不同，慢速冷冻的速率越快，对胚胎的损伤越大，胚胎死亡率越高，透明带破损率越高，囊胚率越低。

参考文献：

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[4] ZHU S E，KASAI M，OTOGE H ，et al.Cryopreservation of expanded mouse blastocysts by vitrification in ethylene glycol-based solutions[J].J Reprod Fertil，1993，98：139-145.

[5] ALI J，SHELTON JN.Design of vitrification solutions for the cryopreservation of embryos[J]. J Reprod Fertil，1993，99：471-477.

[6] EMILIANI S，VAN DEN BERGH M，VANNIN A S， et parison of ethylene glycol，1，2-propanediol and glycerol for cryopreservation of slow-cooled mouse zygotes，4-cell embryos and blastocysts[J].Hum Reprod，2000，15：905-910.

[7] 罗明久，刘 娜，苗德强，等.应用乙二醇冷冻小鼠胚胎：优化和简化程序的探索[J].生物工程学报，2005，21（5）：766-772.

[8] 孙艳香，姜国诚，雷俊英.小鼠囊胚玻璃化冷冻保存研究[J].广西师范大学学报，2002，20（3）：73-75.

[9] TAO J，TAMIS R，FINK K.Cryopreservation of mouse embryos at morula/compact stage[J].J Assist Reprod Genet，2001，18：235-243.

[10] FUKUDA Y，ICHIKAWA M，NAITO K，et al.Birth of nomal calves resulting from bovine oocytes matured，fertilized and cultured with cumulus cells in vitro up to blastocyst stage[J].Biol Reprod，1990，42：114-119.