小鼠胚胎干细胞体外诱导分化成GABA能神经元

[摘要]目的探讨小鼠胚胎干细胞在体外培养向GABA能神经元定向诱导分化的可能性。方法将小鼠胚胎干细胞以“无血清”方法培养,用DMEM/F12、N2、B27及NT4作为诱导分化剂定向诱导分化,分化好的细胞利用免疫荧光技术、流式细胞技术和RT-PCR鉴定。结果在胚胎干细胞诱导分化成神经元后期,免疫荧光显示有 GABA能神经元存在;RT-PCR结果证实有GABA能神经元正确分化的重要调控基因Viaat、Gad1和Gad2基因表达;流式细胞仪计数结果显示GABA阳性细胞约占总细胞数的(11.49±6.86)%。结论小鼠胚胎干细胞经体外培养可以定向诱导分化成GABA能神经元,可作为神经移植的新来源。

[关键词] 胚胎干细胞; 诱导; 分化; GABA

[中图分类号] R329.28 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)13-06-02

In Vitro Culture and Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cell to GABAergic Neurons

WU Yang1 GUAN Yunqian2 HOU Hongwei1 WANG Yuping2 YANG Conglin1

1.Department of Neurology,Harbin No.5 Hospital,Harbin 150040,China;2.Department of Neurology,Xuanwu Hospital of Capital Medical University,Beijing 100053,China

[Abstract] ObjectiveTo investigate the possibilities of in vitro culture and differentiation of mouse embryonic stem cell to GABAergic neurons. MethodsMouse embryonic stem cells were cultured and induced into GABAergic neurons in serum-free cultural condition. Immunofluorescence,reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and flow cytometer assay were used to identify the properties of the differentiated cells. ResultsIn the later period of differentiation of embryonic stem cells into neurons,immunofluorescence showed that GABAergic neurons existed,RT-PCR results confirmed the important regulatory genes Viaat,Gad1 and Gad2 gene expression due to the correct differentiation of GABAergic neurons and flow cytometry analysis showed the GABA-positive cells accounted for about(11.49±6.86)% of the total cell number. ConclusionMouse embryonic stem cells can be induced into GABAergic neurons in vitro in serum-free cultural condition,providing a new source of nerve graft.

[Key words]Embryonic stem cell; Induce; Differentiate; GABA

干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的研究方兴未艾,且取得了一定成果,但由于其多取材于胚脑的神经干细胞,为日后临床应用埋下了伦理道德问题之患,并且受到供体来源短缺的限制[1]。而胚胎干细胞是能在体外培养的高度未分化细胞,具有多潜能性,可以诱导分化成多种组织细胞。如果能稳定的、并且程序化的将胚胎干细胞定向诱导分化成特定类型的神经元,不但可以解决上述问题,还可以使供体细胞对不同神经系统疾病更具靶向性[2]。本文对小鼠胚胎干细胞在体外培养条件下诱导分化成GABA能神经元进行了初步研究,为日后采用源于胚胎干细胞的GABA能神经元移植治疗难治性癫痫等神经系统疾病奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

鼠胚胎干细胞(mESC 系)由宣武医院细胞中心惠赠。ESC培养基:DMEM,150mL/L ESC专用胎牛血清(Embryonic stem cell specific fetus bovine serum,ES-FBS),100mmol/L非必须氨基酸,0.55mmol/L β-巯基乙醇、L-谷氨酸、青霉素。使用前添加人类白血病抑制因子(human leukaemia inhibitory factor,hLIF)。ITSFn 筛选培养基[3]:5μg/mL 胰岛素(Insulin),50ng/mL转铁蛋白(tran- sferring),30nmol/L硒酸钠(Sodium Selenium),5μg/mL纤维连接蛋白(fibronectin)。增殖培养基:DMEM/F12加入N2、B27及10ng/mL bFGF。分化培养基:DMEM/F12中加入N2、B27及20ng/mL NT4。

1.2 方法

1.2.1 胚胎干细胞的培养及诱导分化 将mESC 1∶5传代到0.1%明胶铺底的塑料培养瓶,在使用上述普通ES培养基前添加hLIF,终浓度1000U/mL。用胰蛋白酶将ESC消化成为单细胞,按照2.5×104/cm2接种到低粘附性的细菌培养皿,用撤除LIF的ESC培养基加10%FBS培养4d,细胞由接种时的单细胞长成悬浮的圆形细胞团,即胚胎体(embryonic body,EB)。将消化好的EB接种到新25cm2普通培养瓶,添加无hLIF的ES培养基培养24h,然后用无血清培养基ITSFn培养,连续富集巢蛋白阳性细胞6d。将富集后的细胞消化成为单细胞,按照(1.5～2)×105/cm2的密度接种到新的细胞培养瓶,添加增殖培养基培养,隔日换液,连续培养6d,扩增完毕后用分化培养基培养6d[4,5]。

1.2.2 免疫荧光检测 分化好的细胞用4%多聚甲醛固定20min,0.01mmol/L磷酸盐缓冲液漂洗3次,0.3%tritonX-100孵育30min。1%BSA(牛血清白蛋白)封闭30min。加入一级抗体,分别是:GABA能细胞标记-小鼠抗小鼠GABA抗体,神经元标记-小鼠抗小鼠Tuj-1(β-tublin-Ⅲ)抗体,星形细胞标记-小鼠抗小鼠GFAP抗体。一抗4℃孵育过夜,0.01mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3次,荧光二抗室温孵育1～2h,荧光标记的二抗为羊抗鼠Cys2、羊抗兔Texas Red。,然后于荧光倒置显微镜Nikon 2000-U观察,SPOT-RT冷却式数字显微摄像系统拍照。

1.2.3 流式细胞技术检测 采用间接免疫荧光标记法,上述方法诱导分化的神经元细胞悬液进行标记,取106细胞加特异的第一抗体,4℃温度下静置15～30min。一抗为小鼠抗小鼠GABA抗体。加缓冲液离心清洗2次后,吸尽残留液体,弹散沉淀,加入荧光标记的第二抗体,4℃静置30min。缓冲液离心清洗2次后,加入适量缓冲液进行流式细胞仪计数。

1.2.4 RT-PCR检测 GABA能神经元重要分化调控基因引物(5'至3'排序)[6]:Viaat[572bp](TTCTGTCCTTTTCTCCCGCCCCGCCGCC;GCACCACCTCCCCGTCTTCGTTCTCCTC);Gad1[302bp] (CCTTCGCCTGCAACCTCCTCGAAC;GCGCAGTTTGCTCCTCCCCGTTCTT);Gad2[583bp](ACTCTGGCATTTCTACAAGATGTTATGA;GAATCACACTGTCTGTTCCAATCCCTA)。使用invitrogen试剂盒,反转录48℃,45min;预变性94℃,2min;变性94℃,30s;退火58℃,1min;延伸68℃,1min。变性、退火、延伸3个步骤重复40个循环,然后经68℃,10min让产物充分形成。

2 结果

2.1 免疫荧光检测结果

免疫荧光可见,诱导分化后期的细胞中GFAP(封三图1)、GABA(封三图2)、Tuj-1(封三图3)阳性,说明在胚胎干细胞诱导分化阶段有GABA能神经元存在。

2.2 流式细胞检测结果

GABA阳性细胞计数(χ±s):(11.49±6.86)%。流式细胞检测结果说明在胚胎干细胞诱导分化的神经元后期GABA阳性细胞约占总细胞数的(11.49±6.86)%。

2.3 RT-PCR结果

ESC经过上述诱导分化后,可见与引物相同的PCR扩增条带,说明有GABA能神经元正确分化的重要调控基因Viaat,Gad1和Gad2基因表达。RT-PCR产物凝胶电泳结果如封三图4。

3 讨论

胚胎干细胞是源于囊胚的内细胞团或者早期胚胎的原始生殖细胞,具有多向分化的潜能以及不断增殖的能力。目前已经可以从ESC中诱导出神经细胞、心肌细胞、血细胞、肝细胞等[2,7]。对于ESC向神经元的诱导分化有维甲酸诱导法和无血清诱导法,后者具有分阶段可调控性和极少胚胎期幼稚细胞的优点[8-9],故本实验采取该方法。

ESC向神经元的定向诱导分化的目的之一是为了能够于移植治疗中枢神经系统疾病,而中枢神经系统疾病往往是神经细胞某种特定亚型的减少或者其分泌的某种特定神经递质的不足,这就需要我们能将ESC向单一类型的神经细胞定向分化、纯化,并且能进行大量克隆增殖。其定向诱导分化过程需要不同神经营养因子、转录因子、细胞专一蛋白等的参与,这些成分的种类、浓度、比例决定了诱导分化后的细胞的类型[10]。

本实验尝试采用DMEM/F12、N2、B27以及NT4作为诱导分化剂,免疫荧光结果表明:有GABA能阳性神经元存在,RT-PCR结果证实有GABA能神经元正确分化的重要调控基因Viaat、Gad1和Gad2基因表达,说明该方法可以定向诱导分化出GABA能神经元,流式细胞检测结果显示GABA能神经元数占总细胞数比例略低于国外文献报道[6]。

本实验结果表明,除GABA能神经元外,尚有其他类型的神经细胞,并有少数胚胎期幼稚细胞,GABA能神经元的比例不是很高,提示我们如何对小鼠胚胎干细胞在体外定向诱导分化GABA能神经元进一步调控、去除幼稚细胞、提高GABA能神经元的比例,是我们日后研究的重点。

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(收稿日期:2010-03-06)