曲牙土天牛高毒力绿僵菌菌株筛选

【前言】曲牙土天牛高毒力绿僵菌菌株筛选由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。1.1 绿僵菌菌株 共计36株，其中17株由本实验室分离自广东化州化橘红基地土壤中，2株来自重庆市中药研究院， 9株来自中国农业科学院植物保护研究所农业部生物防治重点实验室，8株来自安徽省微生物防治重点实验室，其中菌株mf05为黄绿绿僵菌Metarhizium flavoviride， m...

[摘要] 目的：明确昆虫病原真菌绿僵菌对化橘红害虫曲牙土天牛幼虫的毒力，筛选高致病力菌株，为曲牙土天牛的生物防治提供依据。方法：先利用从化橘红基地土壤中分离及其他实验室提供的36株绿僵菌，制成孢子浓度为1×108 个/g的孢子土，对曲牙土天牛1龄幼虫进行初步的毒力测定；在此基础上选取7株分离自化橘红基地土壤的绿僵菌作进一步筛选；并通过液固双相发酵法对筛选出的高毒力菌株的产孢能力进行初步评价。结果：用于作初步毒力测定的36株绿僵菌中，有28株能够侵染曲牙土天牛幼虫，其中6株僵虫率达100%，8株达80%，8株达60%，2株达40%，4株达20%；用于作进一步毒力筛选的7株菌中，有6株表现出较高的毒力，最高僵虫率均大于74%；对这6株菌的产孢量进行测定，产孢量均大于10亿个/g，其中1，4株菌产孢量显著高于其他菌株，分别为2.35±0.25 （1×109个孢子/g），2.21±0.27（1×109个孢子/g）。结论：1号和4号菌株对曲牙土天牛1龄幼虫表现出了较高的毒力，并有最强的产孢能力，因此最具开发潜力。

[关键词] 化橘红；曲牙土天牛；绿僵菌；毒力测定

虫害防治是目前中药材生产中最薄弱的环节之一，是实施中药材GAP的重点和难点，在绿色中药材的生产中要防止农药对药材的污染，由于目前市场上缺乏有效的、可替代传统化学农药的新型杀虫剂，使得绿色药材生产理念难以贯彻实施，因此开发有效的生物杀虫剂成为亟待解决的问题。绿僵菌Metarhizium是一类通过昆虫体表进行侵染的虫生病原真菌，能够侵染200多种昆虫以及硬蜱等其他节肢动物[1]，目前已经大规模成功应用于防治非洲以及澳大利亚的蝗虫[2]，是一类具有很大开发价值的生物杀虫剂。

化橘红为芸香科植物化州柚Citrus grandis ‘Tomentosa’或柚C. grandis （L.） Osbeck 的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，具有镇咳祛痰的功效，是我国的传统道地药材[3]。近年来化橘红根部受到一种地下害虫曲牙土天牛Dorysthenes hydropiucs pascoes的严重危害，给化橘红生产带来严重损失[4]，由于曲牙土天牛幼虫生活在地下，防治难度大，常规的化学农药很难奏效。作者先前在基地调查时发现，土天牛幼虫有被虫生菌感染的现象，并已从化橘红基地土壤中分离到一批绿僵菌[5]，据此，本研究选择36株绿僵菌对化橘红害虫曲牙土天牛1龄幼虫进行毒力测定，以期筛选出对其具有高毒力的菌株，为利用绿僵菌防治曲牙土天牛奠定基础。

1 材料

1.1 绿僵菌菌株 共计36株，其中17株由本实验室分离自广东化州化橘红基地土壤中，2株来自重庆市中药研究院， 9株来自中国农业科学院植物保护研究所农业部生物防治重点实验室，8株来自安徽省微生物防治重点实验室，其中菌株mf05为黄绿绿僵菌Metarhizium flavoviride， mt05为戴氏绿僵菌M.taii，其余菌株均为金龟子绿僵菌M.anisopliae。

1.2 SDY液体培养基 1 L培养液含酵母浸膏10 g，蛋白胨10g，葡萄糖40 g。

1.3 大米培养基 200 g大米装入体积8 cm×9 cm×34 cm、一端开口的聚丙烯食用菌菌种袋里，加60 mL水，混匀，静置0.5 h使大米充分吸水后，拧拢袋口，120 ℃高压蒸汽灭菌0.5 h。

1.4 曲牙土天牛幼虫 2011年5月底6月初，在广东化州市平定镇天堂嶂的药材基地，夜间利用灯光诱捕曲牙土天牛成虫，配对繁殖饲养获得。

1.5 仪器 北京发恩科贸有限公司D-1型自动蒸汽灭菌锅；太仓市实验设备厂TH2-D台式恒温振荡器；湖北黄石恒丰医疗器械有限公司MJ-01型霉菌培养箱；Leica DM2000显微镜与Leica DFC425 C显微数码相机组合的成像系统。

2 方法

2.1 绿僵菌分生孢子制备 向长满绿僵菌孢子的试管斜面中注入2 mL 0.5% 的灭菌聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温-80）溶液，利用接种钩刮动孢子块使其从培养基上脱离并分散开，摇动斜面使孢子充分悬浮。将孢子悬浮液倒入含40 mL SDY培养液的三角瓶中，25 ℃，140 r·min1，摇瓶培养72 h。将培养好的菌液倒入含有大米培养基的菌种袋里，拌匀使菌液均匀分布到大米基质中，将菌种袋平放，撑开袋体，使大米培养基能充分与空气接触，拧拢菌种袋口避免外界杂菌进入，同时留一定缝隙以供气体交换，将菌种袋置于25 ℃恒温培养箱中、自然光照培养约2周，当绿僵菌开始大量产孢时，完全打开发酵袋口以便袋内水分排出，继续培养一周完成发酵。利用孢子收集器从发酵物料里面收集纯孢粉，纯孢粉在变色硅胶干燥器中室温干燥1周，4 ℃保存备用。称量一定质量的孢子粉用0.5%吐温-80水溶液悬浮，利用血球计数板计数、计算出每克纯孢粉的孢子含量。

2.2 高毒力菌株的初步筛选 绿僵菌孢子粉在进行毒力测定前先进行孢子萌发实验，保证用于测试的孢子粉萌发率大于95%。纯孢粉经精密称重后保存在密闭的离心管中，防止在基地潮湿的环境中萌发，根据纯孢粉的孢子密度及质量，用灭菌的干燥细沙将纯孢粉制成1×1010 个/g的储备孢子土，在实验前用经过太阳暴晒消毒的干燥沙土将储备孢子土逐级稀释到毒力测定所需的浓度，毒力预测定孢子1×108个/g，在直径6 cm的培养皿中放置数段灰叶豆的根及1小片滤纸作为土天牛幼虫的食物，倒入孢子土，滴适量水使孢子土润湿（但不积水），每个培养皿中放入5头曲牙土天牛1龄幼虫，另设一个不含孢子的土样做对照，所有处理均不设重复，室温放置（25～30 ℃），每天观察，适时给孢子土补充水分以保持湿润，7 d后调查绿僵菌感染幼虫情况。

2.3 高毒力菌株的进一步筛选 根据2.2的筛选结果，选取7株绿僵菌做进一步的毒力测定，首先在220 mL的一次性塑料杯中放置数段灰叶豆的根及1小片滤纸作为土天牛幼虫的食物，倒入25 g孢子土，向孢子土中滴入适量水使其润湿，每个杯中放入20头1龄土天牛幼虫，在杯口覆上塑料保鲜膜，用橡皮筋扎住，在保鲜膜上打数个孔，以起到保水、透气及防治幼虫逃逸的作用。每株菌设1×108，1×107，1×106个/g 3个孢子浓度，每个浓度设3个重复，用不含孢子的细沙做3组对照，7 d后统计曲牙土天牛幼虫被感染的结果。

2.4 高毒力菌株的产孢能力评价 根据2.3的筛选结果，选取6株高毒力的菌株进行产孢量测定，以初步比较各菌株的生产潜力。用SDY培养液与大米固体培养基对各菌株进行液固双相发酵培养，首先用灭菌的0.5%吐温-80溶液，将同一批次接种、保存在斜面中的绿僵菌孢子配成1×107个孢子/mL的孢子悬浮液，每个盛有40 mL SDY培养液的三角瓶里接种2 mL孢子悬浮液，每个菌株做3个重复。将孢子悬浮液倒入含40 mL SDY培养液的三角瓶中，25 ℃，140 r·min1，摇瓶培养72 h。将培养好的菌液倒入含有大米培养基的菌种袋里，拌匀使菌液均匀分布到大米基质中，将菌种袋平放，撑开袋体，以使大米培养基能充分与空气接触，拧拢菌种袋口避免外界杂菌进入，同时留一定缝隙以供气体交换，将菌种袋置于25 ℃恒温培养箱中、自然光照培养约2周，当绿僵菌开始大量产孢时，完全打开发酵袋口以便袋内水分排出，继续培养1周完成发酵。待固体发酵结束后，扎紧发酵袋口，将物料捣碎并混合均匀，称量100 mL三角瓶的质量为M1（精确到0.01 g），向其中加入约20 g发酵物料，置于60 ℃烘箱烘至恒重，称量质量为M2，向三角瓶中注入70 mL 0.5%的吐温-80溶液并放入2颗玻璃珠，用封口膜扎住三角瓶口，置于摇床上，140 r·min1摇瓶1 h，使孢子充分悬浮到溶液中，将孢子悬浮液稀释100倍，利用血球计数板统计孢子浓度，并计算出三角瓶中的孢子原始浓度C（孢子/mL）。

计算出每克干物料里的孢子含量即产孢量=70×C/（M2-M1）。在SPSS数据分析软件中，利用新复极差（Duncan）法对各菌株的产孢量进行差异性比较。

3 结果与分析

3.1 绿僵菌对曲牙土天牛幼虫的毒力作用 将曲牙土天牛幼虫放入含孢子土的培养皿中，白色的幼虫打洞钻入土里，从培养皿底部可以看到清晰的虫道，7 d后统计发现，对照组幼虫健康存活，有的钻入灰叶豆或化橘红韧皮部与木质部之间取食，有的停留在培养皿底部的滤纸上，滤纸上也形成明显的虫道。对36株绿僵菌做初步的毒力测定，结果见图1。受测的36株绿僵菌里有8株未出现僵虫，28株表现出不同程度的毒力，其中6株僵虫率达100%，8株达80%，8株达60%，2株为40%，4株为20%。受绿僵菌感染的幼虫有的只是身体僵直，体表没有长出明显的菌丝，有的体表已经长出白色的菌丝，部分幼虫体表已经长满橄榄色的孢子，未受感染的幼虫钻蛀进化橘红或灰叶豆的根里。

综合绿僵菌对曲牙土天牛幼虫的初步毒力结果，以及前期在实验室内观察到的各菌株的产孢能力，挑选了7株分离自化橘红基地土壤的金龟子绿僵菌小孢变种菌株M. anisopliae（Metsch.） Sorokin var. anisopliae Tulloch对曲牙土天牛做进一步的毒力测定，结果见图2，6株绿僵菌对曲牙土天牛一龄幼虫表现出了良好的毒力，其中菌株27-2在孢子浓度1×107个/g时僵虫率最高，达94.3%，菌株 22-3-2，4，31，1，15-2，18-1的最高僵虫率依次降低分别为82.9%，79.2%，77.3%，76.0%，74.3%，40%，菌株22-3-2，31的毒力随着孢子浓度的降低而依次减弱，其他菌株在孢子为1×108个/g时的毒力不及孢子为1×107个/g，对1×107个/g，1×106个/g 2个孢子水平的考察分析发现，菌株的毒力随着孢子浓度增高而增强。

3.2 高毒力菌株的产孢能力评价 在预实验的基础上选取了7株绿僵菌作进一步的筛选，发现其中6株表现出较高的毒力，随即对6株菌株的产孢能力进行比较，进一步评价其应用潜力。6株供试的绿僵菌，每克物料的孢子含量均可达到10亿孢子以上，其中1，4菌株产孢量明显高于其他菌株，特别是1号菌株产孢量与其他菌株有极显著差异，菌株27-2的产孢量最低，其他菌株间的产孢量差异较小，见表1。

4 讨论

前期的研究工作显示化橘红基地湿热的环境有利于绿僵菌的生存[5]，本研究在利用36株绿僵菌对曲牙土天牛1龄幼虫进行初步毒力测定时，有多株绿僵菌表现出良好的毒力，选取其中7株分离自化橘红基地的绿僵菌做进一步毒力测定，发现6株毒力较高，这些菌株由于都是分离自化橘红基地，因此对基地的环境应该有较强的适应性，这为进一步的田间应用提供了有效的保障。菌株1，4的产孢量明显比其他菌株要高，表现出良好的开发潜力。本研究供试的曲牙土天牛为孵化不久的1龄幼虫，因为1龄幼虫相对容易饲养，理论上也更容易受到绿僵菌的侵染，将来在田间使用时可以在曲牙土天牛卵集中孵化的6月中旬进行田间施用绿僵菌以控制初孵的天牛幼虫。由于目前不易通过人工饲养或是田间捕捉获得足够数量的高龄曲牙土天牛幼虫，因此在以后能够获得足量虫源时也应当对高龄幼虫做进一步的毒力测定，为制定相应的防治策略提供更多依据。

绿僵菌是一类土壤里常见的昆虫病原真菌，不仅能寄生节肢动物，还能营腐生或与植物根系共生，与植物共生的绿僵菌能够促进植物根系的生长[6]，在接受植物的有机营养的同时能够为植物提供氮，磷等无机营养，通过与其他病原真菌在根围环境的竞争作用保护植物免受侵害，同时绿僵菌还可以寄生地下害虫对植物提供更多的保护[7]，因此，有关利用绿僵菌防治药材害虫的研究值得进一步开展。

[参考文献]

[1] Ojeda-Chi M M， Rodriguez-Vivas R I， Galindo-Velasco E， et al. Laboratory and field evaluation of Metarhizium anisopliae （Deuteromycotina： Hyphomycetes） for the control of Rhipicephalus microplus （Acari： Ixodidae） in the Mexican tropics[J]. Vet Parasitol，2010，170（3）：348.

[2] Frazzon A P G， Vaz Junior I S， Masuda A， et al. In vitro assessment of Metarhizium anisopliae isolates to control the cattle tick Boophilus microplus[J]. Vet Parasitol，2000，94（1/2）：117.

[3] 中国药典.一部[S].2010：69.

[4] 陈荣敏，陈君，于晶，等. 橘红害虫及天敌种类调查[J]. 中药材，2009，31（11）：1615.

[5] 马维思，徐江，乔海莉，等化橘红GAP基地土壤绿僵菌的分离鉴定[J]. 中国中药杂志， 2012，37（7）： 887.

[6] Sasan R K， Bidochka M J. The insect-pathogenic fungus Metarhizium robertsii （Clavicipitaceae） is also an endophyte that stimulates plant root development[J]. Am J Bot，2012，99（1）：101.

[7] Barelli L， Padilla-Guerrero I E， Bidochka M J. Differential expression of insect and plant specific adhesin genes， Mad1 and Mad2， in Metarhizium robertsii[J]. Fungal Biol-Uk，2011，115：1174.

Screening for virulence strains of Metarhizium against

Dorysthenes hydropicus pascoes

MA Wei-si1，4， QIAO Hai-li1， NONG Xiang-qun2， CHEN Jun1*， YU Jin1，

QIN Rong-min3， XU Chang-qing1， XU Jiang1， LIU Sai1， LI Xiang-ming3， CHENG Hui-zhen1

（1.The Key Laboratory of Bioactive Substance and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine，

Ministry of Education， Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Science & Peking

Union Medical College， Beijing 100193， China；

2. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China；

3.Huazhou Green Co.， Ltd.， Huazhou 525100， China；

4. Institute of Medicinal Plants， Yunnan Academy of Agriculture Science， Kunming 650223， China）

[Abstract] Objective： The aim of the present study was to screen the Metarhizium strains with high virulence against the larvae of Dorysthenes hydropicus， a serious pest of Citrus grandis. Method： Thirty six strains of Metarhiziums were isolated from the soil of C. grandis GAP base and collected from other institutions， and the pathogenicity of these strains against 1st instar larvae of D. hydropicus was detected at concentration of 1×108 conidia/g. The high violence strains against D. hydropicus were cultivated in sabouraud dextrose yeast medium at first， then transfer to rice grain. And the sporulations of these violent strains against D. hydropicus were detected. Result： Twenty-eight strains showed virulence against D. hydropicus by preliminary study， and 7 strains of them were collected for further study， 6 of the 7 showed high virulence， the highest cadaver rate was higher than 74%. The conidia production of strain 1 and strain 4 were 2.35±0.25 （1×109 conidia/g）， 2.21±0.27（1×109 conidia/g）， respectively， showed significantly higher than other strains. Conclusion： strain 1 and strain 4 of the 36 Metarhiziums strains showed high virulence against D. hydropicus， and the highest sporulation ability， so they have a best application prospect.

[Key words] Citrus grandis‘Tomentosa’； Dorysthenes hydropicus Pascoes ； Metarhizium； bioactivity

doi：10.4268/cjcmm20132006