同种异体耳移植的实验研究

[摘要]目的:①观察同种异体兔耳移植后排斥反应的组织病理学、细胞免疫、体液免疫变化的情况;②为提高同种异体移植耳成活率,预防排斥反应,提供一个有效的免疫抑制治疗方案。方法:以青紫蓝兔和日本大耳白兔为实验动物。以耳大动、静脉及外侧耳缘静脉为蒂,获得单侧(右)全耳,应用显微外科微血管吻合技术进行异体移植。其中青紫蓝兔为受体,日本大耳白兔为供体。实验共选用40对(青紫蓝兔和日本大耳白兔各40只)动物,按受体免疫抑制剂治疗方案随机分为5组:O组,手术对照组(N=5对),行自体兔耳离断回植术;C组,对照组(N=5对),同种异体耳移植后不给予免疫抑制剂;T1组(N=10对),同种异体耳移植后给予FK506单一免疫抑制剂;T2组(N=10对),同种异体耳移植后给予FK506 和强的松两联免疫抑制剂;T3组(N=10对),同种异体耳移植后给予FK506、MMF和强的松三联免疫抑制剂。动脉、静脉吻合均选用端端吻合技术。术后观察移植耳存活情况、急性排异发生率及严重程度;供体组织病理分级;受体血浆IL-2、IL-4、 IL-8的变化以及受体T淋巴细胞CD4+、CD8+的变化。结果:同种异体兔耳移植30天、100天后T3组在急性排斥反应发生率、供体组织病理分级和受体IL-2、IL-4、 IL-8水平与CD4、CD8值的变化等方面与C组、T1组、T2组相比较均有显著差异(P

[关键词]同种异体移植;耳再造;免疫抑制;排斥反应

[中图分类号]R622Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)03-0353-05

Research of ear allotransplantation in rabbbits

LIU Ping,LIU Yi,ZHANGXu-sheng,ZHANG Bin,XIAO Bin,LI Qiu-jin

(Department of Burns and Plastic Surgery, Lanzhou General Hospital, Lanzhou Command of PLA,Lanzhou 730050,GanSu,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the pathologic changes of rejection after ear allo-transplantation in rabbit,and find an effective therapic strategy of immune suppression to improvethe survival rate of allotransplanted ear andprerent rejection. MethodsLivid blue rabbits and Japan big ear white rabbits were used as experiment animals. A free right ear based on common auricularis magna artery with auricularis magna vein and auricularis edge vein was harvested from donor (livid blue rabbit), then allotransplanted to recipient (Japan big ear white rabbits) with microvarscular anastomosis technique. 40 couples of rabbits were divided into five groupsrandomly according to different scheme of immunosuppressive treatment. Group O (n=10) and group C (n=5) were auto-transplantion and allo-transplantation respectively, and were not given any immunosuppressive agent. Group T1, T2 and T3 (each with ten couples of rabbits, n=10) were givenFK506, FK506 combined with prednisone and FK506 combined with prednisone plus respectively. Then, the survival rates of transplanted ears, the incidence rate of rejection and its histopathologic grade, the levels of IL-2, IL-4 and IL-8 in plasma and CD4+, CD8+ in lymph cells of donor rabbits were examined.Results At day 30, 60 and 100 after allotransplantation, the incidence rate of rejection, thehistopathologic grade of skin biopsy specimen and the expression levels of IL-2, IL-4 and IL-8 were significantly lower in Group T3 than the other groups,all examined indexes above showed obvious difference from those in group C, group T1 andgroup T2 (P

Key words: allograft; auricle reconstruction; immunosuppression;immunologicreaction

严重烧伤、创伤、肿瘤术后以及先天性因素所致耳缺损、耳畸形的患者,除了在生理上承受因耳缺损、畸形所造成的功能障碍外,在心理上也承受着极大的痛苦。全耳再造术是整形外科体表器官再造中最困难、最具挑战性的工作,目前的修复手段仅能做到使耳郭的形状和正常耳大致相似,还不能使其各细微结构和软骨的弹性完全与正常耳匹配[1],而且肋软骨的切取破坏了胸廓的完整性,再造耳软骨支架的吸收变形则严重影响再造耳外形的远期效果。

随着新型、高效免疫抑制剂的问世,器官移植得到了飞速的发展,同种异体复合组织移植也取得了令人瞩目的进展,但是同种异体复合组织移植尚存在操作技术、排斥反应、伦理道德等诸多问题。本研究利用兔耳移植模型,旨在探讨同种异体兔耳移植后排斥反应的病理学变化与细胞免疫、体液免疫的变化,研究制定有助于提高移植耳成活率,预防排斥反应的免疫抑制方案,为临床上成功实施同种异体耳移植提供有益的实验基础。

1材料和方法

1.1 实验动物:选用体重均等的40只青紫蓝兔和40只日本大耳白兔为实验动物。体重(1.9±0.1)kg,3月龄,雌雄不限,均购于兰州生物制品研究所动物实验科,由专人负责单笼封闭式饲养。以青紫蓝兔为受体,日本大耳白兔为供体(图1)。

1.2 主要实验试剂:CD4、CD8鼠抗兔试剂盒,购于英国SEROTEC公司, IL-2、IL-4、IL-8鼠抗兔试剂盒,购于美国ADL公司,他克莫司(FK506)胶囊购于英国Aslcllns Ireland 公司,吗替麦考酚酯胶囊(MMF)购于上海罗氏制药有限公司,醋酸泼尼松购于浙江仙琚制药股份有限公司。

1.3 同种异体兔耳移植模型的建立:2%戊巴比妥钠(30mg/kg)耳缘静脉麻醉后,沿供体右耳根处环形剪开皮肤,分离皮下组织,将内侧耳缘静脉与外侧耳缘静脉分支结扎,分离出外侧耳缘静脉、耳大静脉、耳大动脉,将受体同法分离出右耳外侧耳缘静脉,耳大静脉,耳大动脉,血管夹依次阻断血流,剪断血管后用组织剪沿耳根离断受体右耳,结扎出血点,盐水纱布湿敷创面;供体耳大动脉,耳大静脉,外侧耳缘静脉血管夹阻断血流后,依次剪断血管,用组织剪沿耳根剪断右耳;将供体耳软骨与受体耳根软骨对位,先于外侧耳缘静脉旁软骨处缝合固定,再将内侧耳缘静脉旁软骨缝合固定,再在耳大动脉旁固定耳软骨后,间断对位缝合固定耳软骨。将供体颧耳肌与受体耳根颧耳肌对位拉拢缝合,保证术后移植耳竖立。显微镜下将对位的血管旁皮下组织间断缝合固定后,分别吻合外侧耳缘静脉,耳大静脉,耳大动脉,均行端端吻合。吻合毕,依次放开耳大动脉、耳大静脉、外侧耳缘静脉血管夹,即见动脉搏动良好,两根静脉充盈明显,行勒血试验,见动静脉血流通畅,移植耳血运良好,全层缝合皮肤关闭切口(图2)。

1.4 实验分组与免疫抑制剂的应用

1.4.1 实验分组:将40只青紫蓝兔与40只日本大耳白兔按体重大小与耳大小配对,然后按受体应用免疫抑制剂的不同分为5组。O组:手术对照组(N=5对),行自体兔耳离断回植术;C组:对照组(N=5对),异体移植后不给予免疫抑制剂;T1组:(N=10对)异体移植后给予FK506;T2组(N=10对):异体移植后给予FK506 +强的松两联免疫抑制剂;T3组(N=10对):异体移植后给予FK506+MMF+强的松三联免疫抑制剂。

1.4.2 免疫抑制剂的应用:术前1天晚8点及术前30min各组试验动物依据分组不同应用不同的免疫抑制剂,各给药一次。药物及用量分别为:T1组,FK506 0.2 mg/kg;T2组,FK506 0.2 mg/kg,强的松2mg/kg; T3组,FK506 0.2 mg/kg,MMF20mg/kg,强的松2mg/kg。移植术后药物用量分别为:①强的松1mg/kg, 晚8时,1次/天。1月后降为0.5mg/kg,晚8时,1次/天;②FK506 0.2mg/kg,分两次给予,早8时晚8时;③MMF20mg/kg,分两次给予,早8时晚8时。

急性排斥反应发生时用药:①加大强的松用量,行“激素冲击治疗”,2mg/kg,2次/天,连用5天至急性排斥反应缓解后,恢复至正常药量;②加大FK506用量,0.2 mg/kg,2/天,待急性排斥反应控制平稳后恢复至正常药量(一般为10～14天);③青霉素抗炎治疗:青霉素20 000U/ kg,2/天,连续3天。

1.5 观察指标

1.5.1大体观察:术后观察并详细记录移植兔耳的变化(皮温、皮色、肿胀及毛细血管充盈情况等)、存活情况及兔全身反应情况。

1.5.2 病理检查与病理学分级观察:分别在术后30天与100天采集各组移植耳标本进行组织病理学检查:以移植兔耳内侧面画“十”字定为兔耳正中处,“十”字正中交叉点旁偏内侧1 cm处手术刀切取全层组织, 10%福尔马林固定,常规脱水、包埋、切片、HE染色,光镜下观察各组标本组织结构及细胞浸润的情况。确定排异反应的轻重并分级。排斥反应依据Muramatsu[2]的分类按轻重程度分为四级:0级,无排斥反应;1级,轻度排斥反应;2级,中度排斥反应;3级,重度排斥反应。对各组30、100天的病理学标本进行分级总结,而后进行统计学分析,确定各组的免疫抑制效果。

1.5.3 细胞免疫状态观察(CD4+、CD8+测定):分别在术前、术后7、14、30、100天采取静脉血,用流式细胞仪计数检测各组受体血清中T淋巴细胞亚群CD4+与CD8+的含量,及CD4+/CD8+值。

1.5.4 体液免疫状态观察(IL-2,IL-4,IL-8测定):分别在术前、术后7、14、30、100天采取静脉血,用ELISA法检测各组受体血清中IL-2 ,IL-4,IL-8水平的变化。

1.5.5 术后并发症观察:术后观察手术伤口有无感染,有无皮癣、肺炎、肠炎等并发症发生情况。

1.6 统计学分析:所有数据以x±s表示,并采用SPSS 11.0统计软件处理。病理分级结果采用秩和检验,进行统计学分析;CD4+、CD8+、CD4+/CD8+与IL-2、IL-4、IL-8用重复测量方差分析进行统计学分析,P

2结果

2.1大体观察:排斥反应大体表现为:移植耳皮肤组织质地由耳根到全耳逐渐肿胀、变硬,肤色变红,局部皮温升高,随着肿胀逐渐加重,肤色逐渐加深,移植耳内外皮肤表面部分区域出现水疱、组织液渗出、表皮溃烂,及脱毛等症状,随后局部皮肤出现暗红、青紫色斑块,组织继续加剧肿胀、硬化,皮温上升,移植耳渐呈紫黑色,至整个移植耳变黑,温度明显下降,100%坏死。

O组:除1例发生静脉血栓外,其余均未发生任何并发症,9只原位回植耳均成活良好。

C组:术后均发生排斥反应,移植耳坏死。实验动物移植耳术后成活时间:9～11天,平均成活10.2天(1例超急性排斥反应,术后10min发生血管栓塞,致移植耳坏死)。

T1组:均发生排斥反应,移植耳坏死。实验动物移植耳术后成活时间:6～10天,平均成活7.6天(1例术后第2天发生血管栓塞)。

T2组、T3组动物在移植术后100天移植耳存活例数为4例与6例(图3、4)。急性排斥反应共发生7例T2组4例,T3组3例。发生时间分别为:第13、20、40、75天与16、28、67天。经抗急性排斥反应治疗后,成功逆转急性排斥反应3例(T2组1例,T3组2例)。

2.2 各组移植耳排斥反应情况的病理检查:从表2、3中T2组与T3组在30天、100天各组病理学分级可以看出两组病理学分级有差异,T3组的病理学分级明显低于T2组(图5～8)。说明三联用药对同种异体耳移植术后排斥反应的抑制作用明显优于两联用药。

2.3CD4+、CD8+、CD4+/CD8+检测

2.3.1 不同时间点间CD4+的检测结果:表4中T2组的CD4+术后均高于T3组,表示了不同时间段T3组对免疫排斥反应良好的控制。移植术后7～30天是急性排斥易发生的时间段,CD4+呈明显的升高表现,本实验中发现急性排斥反应临床表现还未出现时,CD4+检测值已发生明显的增高。结果提示CD4+为移植后监测急性排斥反应的一项敏感指标。术后不同时间点间CD4+的流式细胞仪检测结果:见图9～12,T2组实验动物与实验动物在术后30天、100天CD4+检测值有明显差异,T3组CD4+均低于T2组,表明三联用药组,对异体排斥反应控制较两联理想。

2.3.2 不同时间点间CD8+的检测结果:各组不同时间CD8+的检测值差异无统计学意义(表5),本实验结果提示CD8水平的检测不能反映移植排斥反应情况。

2.3.3 不同时间点组间CD4+/CD8+值的检测结果:表6中各组不同时间CD4+/CD8+比值对比明显,术后T3组均低于T2组,表明T3组免疫抑制效果较T2组理想。

2.4 IL-2、IL-4、IL-8水平检测

2.4.1 不同时间点IL-2的检测结果:表7检测值中可得到T2组与T3组比较,在不同时间点,T3组Il-2的水平均比较低,说明三联用药组,对异体排斥反应控制良好。

2.4.2不同时间点IL-4的检测结果:表8中T3组在术后30、100天时IL-4水平低于T2组,说明三联用药,对异体排斥反应控制较两联理想。

2.4.3 不同时间点IL-8的检测结果:各组不同时间血清IL-8水平的检测结果差异无统计学意义(表9),可认为T2、T3两组间IL-8无差异、不同时间点IL-8的变化无差异。

2.5 术后并发症:本实验中所有实验动物手术切口均I期愈合,未观察到任何并发症发生。

3讨论

随着现代医学相关学科的快速发展,全耳再造技术日臻成熟,并取得了良好的近期效果,但因再造耳支架缺乏软骨膜,作为支架材料再造耳后其营养问题难以得到充分保障,所以存在软骨吸收变形等问题,由此影响再造外耳的远期效果。于是寻找一种更好的耳再造方法成为学者们研究的重点。同种异体耳移植为小耳畸形、耳缺损的修复再造提供了一种全新的手段。但是同种异体耳移植与其它器官移植不同,心、肝、肺、肾等器官移植者往往伴有严重的危及生命的疾病,应用器官移植可以挽救患者的生命;但对于耳缺损、畸形患者来说,手术治疗完全是为了达到美容目的,但无论是前者还是后者,移植术后均需长期应用免疫抑制剂以预防排斥反应,而长期应用免疫抑制剂,除要承受巨大经济负担外,在目前条件下可能会带来毒副作用,因此,就同种异体耳移植来讲,存在许多伦理学问题。本实验目的是:通过同种异体耳移植的实验研究,探讨适用于同种异体耳移植的可行性以及筛选适宜的免疫抑制治疗方案,为未来的实验与临床研究提供初步实验依据。

免疫抑制剂的应用是控制同种异体器官移植排斥反应,保证手术成功的重点。寻找低毒无害的免疫抑制方案也一直是目前研究的热点。为了有效的抑制急性排异反应,在异体移植后应用CsA(环孢素A)或FK506、Aza(硫唑嘌呤)或MMF、强的松等组成的三联免疫移植剂是一个传统方案,相比较CsA,AZA和强的松等组成的三联抑制方案,FK506、MMF和强的松等组成的三联抑制方案,在器官移植中显示了更加良好的效果。复合组织同种异体移植包括了多种组织成分,皮肤又是抗原性最强的免疫器官,是机体主要的免疫攻击对象。皮肤的免疫排斥比肌肉、骨骼、软骨、肌腱发生早且严重,在进行世界首例的手移植之前,Jones等[3]用猪同种异体肢体移植模型为实验动物,通过各种实验方案的对比,确定了FK506、MMF、和强的松的三联免疫抑制方案的可行性,随后世界各地进行的30余例手移植中基本上都采用以FK506、MMF、和强的松为基础免疫抑制方案,并获得了成功[4]。世界首例与我国首例同种异体颜面移植均应用了FK560、骁悉、强的松为免疫抑制剂的抗排斥方案[5-6]。吴卫真等[7] 对比免疫抑制剂在儿童肾移植中的应用效果后,强烈推荐应用MMF、FK506和强的松三联用药,因为和其它免疫移植方案比较,该方案疗效好,而毒副作用方面没有增加。为了研究同种异体耳移植的免疫抑制方案和手术策略,本实验对比研究了FK506+MMF+强的松, FK506+强的松和单一FK506的免疫抑制效果,结果显示,FK506组术后均发生排斥反应,移植耳在6～10天内死亡;而二联与三联用药组均存活了100天以上;术后30天和100天病理分级对比发现三联用药组免疫排斥反应低于二联用药组;代表机体免疫排斥程度的血清IL-2、IL-4水平、CD4+含量与CD4+/CD8+也显示了相同的结果,由此证明三联免疫抑制方案在同种异体耳移植中可以获得良好的免疫抑制效果。研究证实,免疫抑制剂的使用必须是联合用药,在各种药物协同发挥作用,减少药物剂量的同时,降低了各种药物的剂量,亦有效的降低了个别药物的毒性,可以达到增效减毒的效果。通过本实验对比研究发现,与二联用药组比较,三联用药组并没有在术后并发症等方面存在差别。也就是说,从药物的毒副方面考虑,三联用药并不强于两联、单一用药。

器官移植后发生排斥反应是导致受者死亡的最重要原因之一。器官移植后排斥反应发生时有许多细胞因子(Cytokine)参与这一复杂过程,其中白细胞介素(Interleuking)与移植排斥反应密切相关,如IL-2,IL-4,IL-8,IL-10,IL-15等。据文献报道,器官移植后IL-2,IL-4表现为升高[8]。本实验结果也显示同种异体耳移植术后IL-2,IL-4水平较术前明显增高,而IL-8在监测过程中无明显变化规律。

有学者认为CD4和CD8在移植排斥反应中起重要作用[9],临床上人们常把CD4+T细胞与CD8+T细胞改变看作免疫功能异常的指标。CD4+/CD8+的比值代表了整体的免疫平稳,所测指标可较好的检测排斥反应的发生。本实验结果提示:CD4+为移植后监测急性排斥反应的一项敏感指标,CD8+则不能体现移植排斥反应的情况;二联用药组与三联用药组各组不同时间CD4+/CD8+比值对比明显,三联用药组均低于二联用药组,表明CD4+/CD8+比值可以检测免疫抑制的效果。

Tobin GR[10]在同种异体复合组织移植的进展与现状中总结认为:“免疫配型、良好的免疫抑制方案、术前精心的患者及其家人生理与心理准备及术后强有力的免疫抑制剂支持与排斥反应监测,是保证同种异体复合组织移植成功的关键。在所有同种异体复合组织移植失败原因报告中均由以上因素的过失所引起。这些宝贵的早期经验使同种异体复合组织移植成为临床常规的治疗手段变得十分可能”。对于同种异体耳移植来讲,除了前述因素外也存在着诸如异体耳来源问题、医学伦理问题以及同种异体耳移植后必须承担长期服用免疫抑制剂的风险和经济负担问题,所有这些问题都是在同种异体耳移植应用于临床前临床医师必须认真思考并妥善解决的问题。

综上所述,同种异体耳移植单纯从技术层面上讲是可行的,FK506、MMF和强的松结合的三联免疫抑制治疗方案,可明显减轻同种异体兔耳移植后的排斥反应,是预防和治疗同种异体兔耳移植排斥反应的一个有效的治疗方案。

[参考文献]

[1]庄洪兴.耳廓整形与美容[M]//王炜.整形外科学.杭州:浙江科学出版社,1999:1062-1094.

[2]Muramatsu K,Doi K,Akino T,et al. Longer survival of rat limb allograft: combined immunosuppression of FK-506 and 15-deoxysp ergualin[J]. Acta Orthop Scand,1997,68:581-585.

[3]Jones JW Jr,Ustuner ET,Zdichavsky M,et al. Long-term survival of an extremity composite tissue allograft with FK506-mycophenolate mofetil therapy[J]. Surgery,1999,126(2):384-388.

[4]Kvernmo HD,Gorantla VS,Gonzalez RN,et al. Hand transplantati on. A future clinical option[J]? Acta Orthop,2005,76(1):14-27.

[5]张旭东,郭树忠,韩岩,等.部分异体颜面移植围手术期药物治疗的病例报道.中华整形外科杂志,2007,23(3):370.

[6]Devauchelle B,Badet L,Lengele B,et al.First human face allograft:early report[J]. Lancet,2006,368(9531):181-183.

[7]吴卫真,叶礼燕,谭建明,等. 儿童肾移植21例报告[J].中华儿科杂志,2003,41(11): 804-807.

[8]Taylor AL,Gibbs P,Bradley JA. Acute graft versus host disease fillowing liver transplantation:the enemy within[J].Am J Transplant 2004:4:466-474.

[9]张卫民,朱争艳.T细胞亚群检测在肾移植排斥反应与环孢素A中毒鉴别诊断中的应用[J]. 生物医学与临床,2008,1(12):64-66.

[10]Tobin GR, Breidenbach WC 3rd, Pidwell DJ, Transplantation of the hand, face, and composite structures: evolution and current status[J].Clin Plast Surg,2007,34(2):271-278.

[收稿日期]2009-11-12 [修回日期]2010-01-29