GFP-HPV18 E2及其突变体融合蛋白在真核细胞内的表达与定位

摘要：目的：研究HPV18 E2及其N端(TAD)、C端(DBD)与GFP融合蛋白在巨噬细胞（MΦ）内的表达与定位。方法：将真核表达载体pEGFP-C1/E2、pEGFP-C1/TAD和pEGFP-C1/DBD及pEGFP-C1分别转染MΦ，48h后用倒置荧光显微镜观察荧光情况，以确定GFP及融合蛋白的表达；以抗GFP抗体为一抗作Western blot检测相应蛋白质的表达。结果：在荧光显微镜下，4种质粒转染的细胞，pEGFP-C1组细胞内均有荧光；pEGFP-C1/E2组荧光主要在细胞核，但细胞浆也有；pEGFP-C1/DBD仅在细胞核有荧光，pEGFP-C1/TAD仅在细胞浆有荧光。Western blot检测到GFP-HPV18 E2及其突变体融合蛋白在细胞内的表达。结论：GFP-E2及其突变体融合蛋白均能在巨噬细胞内表达，且GFP-E2主要定位于细胞核，GFP-DBD定位于细胞核内，GFP-TAD定位于细胞浆。

关键词：人瘤病毒18型；E2蛋白；定位

中图分类号： R373.9 文献标识码： A 文章编号： 1008-2409(2007)06-1188-02

Expressionand localization of GFP-HPV18 E2 and its mutants fusion proteins in eukaryotic cells/CHEN Chun-lian, WAN Yan-ping, PENG Jun//The Affiliated Hospital of Guilin Medical College, Guilin 541001, China

Abstract:Objective:To study expression and localization of GFP-HPV18 E2 and its TAD or DBD fusion proteins in macrophages. Methods:The plasmid of pEGFP-C1/ E2, pEGFP-C1/TAD, pEGFP-C1/DBD or pEGFP-C1 was transfected into macrophages，respectively. Their expression and localization were observed with fluorescent microscope. Western blot was used to analyze GFP or its fusion proteins by the anti-GFP antibody as the first antibody.Results:Fluorescence could be observed in the whole cells transfected by pEGFP-C1, mainly in the nuclei of the cells transfected by pEGFP-C1/E2, but only in the nuclei of the cells transfectedby pEGFP-C1/DBD while only in the cytoplasma of the cells transfected by pEGFP-C1/TAD. Western blot showed that the expression of GFP, GFP-E2, GFP-DBD, GFP-TAD fusion proteins. Conclusion:GFP-HPV18 E2 and its mutants could express in macrophages. GFP-E2 fusion protein locate mainly in nuclei, while GFP-DBD fusion protein locate completely in nuclei and GFP-TAD fusion protein locate completely in cytoplasma.

Key words:HPV18; E2; localization

人瘤病毒（human papillomavirus，HPV）18型(HPV18)属高危型，可引起重度不典型性增生，甚至恶性肿瘤[1]。HPV18早期基因区编码的E2蛋白由365个氨基酸(amino acid,aa)组成，分为N端转录活化结构域（transactivation domain,TAD）和C端DNA结合域（DNA-binding domain,DBD），前者有206aa，后者有80aa；两者中间为可变的铰链区（hinge），有79aa[2]。E2蛋白既调节病毒的转录又调节病毒的复制，且通过多种途径影响细胞增殖。巨噬细胞（macrophage, MΦ）是机体抗肿瘤免疫中的重要效应细胞。HPV 感染后，在真皮基质可检测到大量的MΦ[3]。本研究报道GFP-HPV18 E2及其突变体融合蛋白真核表达载体转染细胞后，在细胞内的表达与定位情况。

1 材料和方法

1.1 材料

真核表达载体pEGFP-C1、pEGFP-C1/HPV18 E2、pEGFP-C1/TAD和pEGFP-C1/DBD由本室保存[4]，人单核细胞白血病THP-1细胞购自中国典型培养物保存中心（武汉）。低温高速离心机是HETTICH公司产品；倒置荧光显微镜是日本Nikon公司产品。SofastTM转染试剂购于厦门太阳马生物有限公司。兔抗GFP抗体购于eBioscience公司，HRP标记羊抗兔IgG购自Solarbio公司。

1.2 方法

悬浮细胞THP-1在体外培养经佛波脂（PMA）活化后可分化为贴壁的MΦ[5]。转染前3 d，THP-1细胞用按0.4×109细胞/L转入24孔板，每孔1ml，培养24h后加入终浓度为40 μg/L的PMA诱导48 h。用新鲜培养基洗涤细胞后每孔分别加入3种重组质粒及pEGFP-C1各0.5 μg，同时作空白对照，用SofastTM转染试剂按说明书转染细胞。细胞转染后6 h，用新鲜培养基洗涤2次，每孔加1ml培养基继续培养。用倒置荧光显微镜观察绿色荧光的表达与定位，在表达荧光细胞数量最多时收集细胞，置4 ℃下加入50μl细胞裂解液30 min，10000r/min 4℃离心5min，收获细胞裂解上清液经SDS-PAGE后，以抗GFP抗体为一抗作Western blot鉴定。

2 结果

经倒置荧光显微镜观察，重组质粒能在细胞内表达，其定位如图1所示。GFP-DBD融合蛋白完全表达定位于细胞核内，GFP-TAD完全表达定位于细胞浆，GFP-E2、GFP 在细胞核、浆内均有表达，但GFP-E2表达组细胞核荧光亮度强于细胞胞浆，GFP在细胞核浆内呈均匀表达。转染48 h后发荧光细胞数量最多，收集此时的细胞裂解，Western blot 结果见图2 。图中相对分子质量(Mr)约29400,53400,70700,38600的条带分别与预期GFP,GFP-TAD,GFP-E2,GFP-DBD大小一致。

图1 重组质粒在细胞中表达的荧光显微照片(×400)

Control:对照；GFP：荧光素蛋白；GFP-DBD：荧光素-HPV18 E2 DNA结合结构域融合蛋白；GFP-TAD：荧光素-HPV18 E2转活性结构域融合蛋白；GFP-E2：荧光素-HPV18 E2图2 重组质粒在MΦ表达产物的Western blot分析

1：巨噬细胞裂解物；2：pEGFP-C1转染的巨噬细胞裂解物；

3：pEGFP-C1/TAD转染的巨噬细胞裂解物；4：pEGFP-C1/E2转染的巨噬细胞裂解物；5：pEGFP-C1/DBD转染的巨噬细胞裂解物3 讨论

在与HPV18 相关的宫颈癌中，缺少E2蛋白的表达是HPV18所致宫颈癌的一个重要标志，若在其癌细胞中重新引入E2基因可以抑制HPV致癌基因E6，E7的表达，使细胞周期阻滞止于G1期，细胞可发生衰老或凋亡[6]，说明E2蛋白在癌变过程中可能发生负调控的作用。

MΦ具有较强吞噬和杀伤能力,可调控局部细胞微环境及抑制肿瘤,并能呈递抗原和产生TNF-α，IL-1β等细胞因子，参与机体特异性免疫应答。HPV18 E2蛋白N端结构域含有一段核输出序列（nuclear export sequence,NES），C端结构域含有一段核定位序列（nuclear localization sequence,NLS）[7]。将HPV18 E2及其TAD、DBD与EGFP融合蛋白载体在MΦ中瞬时高表达发现，GFP-DBD融合蛋白完全表达于细胞核内,GFP-TAD完全表达于细胞浆，GFP-E2、GFP在细胞核、浆内均有表达，但GFP-E2主要表达于细胞核内。笔者在后续的研究中发现GFP-E2、GFP-TAD在体外培养的MΦ中瞬时即时高表达上调其TNF-α和IL-1β分泌水平，推测E2蛋白对HPV感染者体内细胞因子水平的改变以及免疫应答方面起重要作用，结果将在相关论文中报道。至于HPV18 E2蛋白上调MΦ分泌TNF-α对机体起何种作用及其机制目前尚不清楚，有待进一步探讨。

参考文献：

［1］ MUNOZ N,BOSCH F X,DE SANJOSE S,et al.Epidemiologic classification of human papillomavirus Types Associated with Cervical cancer［J］. N Engl J Med, 2003,348(6):518-527.

［2］DELL G,GASTON K.Contributions in the domain of cancer research: Review Human papillomaviruses and their role in cervical cancer［J］. CMLS,2001,58(12):1923-1942.

［３］ 顾群，孙脊峰，余春艳，等．尖锐湿疣和寻常疣患者外周血T细胞亚群及细胞因子水平的检测［J］.细胞与分子免疫学杂志，2001，17（4）：397．

［4］陈春莲，彭俊，余敏君，等. GFP-HPV18 E2删除突变体融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定［J］.南华大学学报(医学版)，2007，35（5）：643-645.

［5］LI Y H,BRAUNER A,JONSSON B,et al.Ureaplasma urealyticum-induced production of Proinflammatory Cytokines by Macrophages［J］. Pediatric Research, 2000, 48(1):114-119.

［6］GOODWIN E C,DIMAIO D.Repression of human papillomavirus oncogenes in HeLa cervical carcinoma cells causes the orderly reactivation of dormant tumor suppressor pathways［J］. Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(23):12513-12518.

［7］BLACHON S,BELLANGER S,DEMERET C,et al.Nucleo-cytoplasmic shuttling of high risk human Papillomavirus E2 proteins induces apoptosis［J］.J Biol Chem,2005,280(43):36088-36098.

(收稿日期： 2007-07-06)

注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”