全血PCR直接扩增技术在亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性分析中的应用

摘要： ［目的］应用全血PCR直接扩增技术检测淮安汉族人群亚甲基四氢叶酸还原酶基因MTHFR C677T多态性并分析其地理分布特征，评价该技术在大规模现场人群基因多态性筛检中的应用价值。 ［方法］ 应用全血PCR直接扩增技术分析205例淮安汉族健康个体MTHFR C677T的基因型分布频率，并与传统的聚合酶链反应―限制性片段长度多态性（Polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技术检测结果进行比对。并将检测结果与已报道的不同地区汉族人群资料进行比较。 ［结果］ 全血PCR直接扩增技术与传统PCR-RFLP法测定MTHFR C677T多态性的分布频率具有高度一致性（Kappa=0.946，95%CI：0.906~0.985）。结果表明淮安汉族人群MTHFR C677T的基因型频率分别为CC 32.68%、CT 46.83%、TT 20.49%；C和T等位基因频率分别为56.10%和43.90%；结合其他9个地区的汉族人群MTHFR 677T等位基因频率的趋势性χ2检验，发现MTHFR 677T的分布随地理纬度的降低，T等位基因频率也降低（P=0.001）。 ［结论］ 全血PCR直接扩增技术简便易行，适用于人群基因多态性的快速筛检。在所研究的10个中国汉族人群中MTHFR C677T多态性显示与不同地理纬度的地区分布有统计学相关性。

关键词：外周血；亚甲基四氢叶酸还原酶；单核苷酸多态；筛检技术

文章编号:1006-3617(2007)01-0021-04

中图分类号:R735.1；R394-33

文献标识码:A

亚甲基四氢叶酸还原酶（ methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是叶酸代谢中的关键酶之一，它可将还原型辅酶I （NADPH）相关的5，10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸［1］。前者生物学作用为细胞内一碳基团的传递体，参与嘌呤和嘧啶的合成及DNA修复过程；后者作为甲基供体，在甲硫氨酸合成酶的催化下，同型半胱氨酸接收甲基基团，生成蛋氨酸，并进一步复甲基化为S-腺苷甲硫氨酸，参与体内广泛的甲基化反应。这一代谢途径的正常运转在维持DNA正常甲基化和核苷酸从头合成以及DNA损伤修复是至关重要的［2］。目前研究发现MTHFR基因在人群中具有多态性，C677T是最常见的突变，导致高度保守的丙氨酸突变为缬氨酸，降低黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）与MTHFR结合能力，影响MTHFR的酶活性和热稳定性［3］，可能与神经管缺陷、心脑血管疾病和部分癌症发生的遗传易感性有关。

目前单核苷酸多态（single nucleotide polymorphism，SNP）的检测多采用外周血样本提取的基因组DNA，由于该方法不适于现场操作，且受到样本保存条件和DNA提取效果的限制，在大规模人群SNP筛检中不易推广。本研究采用的全血PCR直接扩增技术，应用特殊的缓冲体系Cocktail PCR Buffer［4，5］，可用全血样本直接进行PCR反应，克服了传统PCR反应对DNA样本的要求高的不足，简化了操作过程，降低了研究成本和技术复杂性。本研究对随机抽取的江苏淮安205例健康体检者采用全血PCR直接扩增技术检测MTHFR C677T的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（Polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP），并与以DNA为模板的传统PCR-RFLP方法进行比较，评价全血PCR直接扩增技术在大规模现场人群易感基因筛检中的应用价值。同时，为进一步认识MTHFR第677位点多态性在中国汉族人群中的分布特征，我们结合已报道的9个不同地区汉族人群MTHFR C677T多态性资料，对MTHFR C677T多态与地理分布的关系进行分析，以了解影响叶酸代谢个体差异的因素，为进一步研究其与相关疾病的关系提供依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

随机抽取江苏淮安常住居民中健康体检汉族个体205名，男性127名，女性78名，年龄17~80（41.44±14.10）岁，调查研究对象的一般情况和吸烟、饮酒习惯，经调查对象知情同意后，同时抽取外周静脉血5 ml，EDTA抗凝，混匀后-20℃保存备用。

1.2 基因型分析

1.2.1 MTHFR的全血PCR直接扩增

留取外周全血样本1 ml直接用于包含MTHFR C677T多态位点的目的片段扩增。引物序列：上游引物5′TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA 3′；下游引物5′AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG 3′；PCR反应体系：包括用于全血PCR反应的Cocktail PCR Buffer 3.93 μl，dNTP 200 μmol/L，引物1 μmol/L，Taq酶1.25 U，加水补充至24 μl，混匀，12 000 g离心5 s后加入全血模板1 μl。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃45 s，35个循环扩增；72 ℃延伸5 min。3%琼脂糖凝胶鉴定PCR产物大小应为198bp。

1.2.2 MTHFR的基因组DNA扩增

取外周全血样本3 ml，留取1 ml用于全血PCR直接扩增，余2 ml全血采用饱和盐析法提取基因组DNA。蒸馏水裂解红细胞后，经蛋白酶K和抽提液处理，0.3 mol/L醋酸钠盐析去除蛋白，异丙醇沉淀DNA后用75%乙醇洗涤，晾干，用Tris-EDTA缓冲液（TE）溶解DNA，测定DNA浓度和D260/D280比值。

PCR反应体系包括10×buffer 2.5 μl，MgCl2 1.6 μl，dNTP 200 μmol/L，引物1 μmol/L，DNA模板1 μl，Taq酶1.25 U，加水补充至25 μl体积。PCR反应条件同前。

随机抽取基因组模板和对应的全血模板的PCR产物共10例进行测序，测序结果与PCR-RFLP和全血PCR直接扩增及RFLP的分型结果进行比对。测序过程由上海申能生物科技有限公司完成。

1.2.3 限制性内切酶分析

上述扩增产物用限制性内切酶Hinf I消化，酶切体系：10×buffer 1.5 μl，Hinf I 3 U，PCR产物5 μl，加水补足体积至15 μl，37 ℃水浴过夜。4%琼脂糖凝胶电泳判断酶切结果：纯合野生型C/C仅有一条198bp条带；纯合突变型T/T可被酶切为175bp和23bp 2个条带；杂合子C/T应包括198bp、175bp和23bp 3个条带。

1.3 统计分析

应用SAS 8.0软件进行统计分析，对全血和基因组DNA的MTHFR C677T基因型检测方法进行Kappa一致性检验。并按照研究人群为中国汉族健康个体、有明确MTHFR C677T基因分型资料的标准纳入已报道的9个中国大陆不同地区的MTHFR C677T多态性研究，遇有同地区健康人群MTHFR C677T多态性资料，采用最大样本量的研究结果。与本次研究对淮安地区205例健康汉族个体的MTHFR C677T传统PCR-RFLP分型结果共同分析，进行不同地区的中国汉族人群MTHFR C677T位点多态性分布频率的比较，对人群聚集地理纬度与T等位基因频率的关系进行趋势性χ2检验。

2 结果

2.1 全血和基因组DNA的MTHFR C677T基因型分析

分别对同一个体的全血样本采用以Cocktail PCR Buffer为缓冲体系的全血PCR直接扩增技术和提取的基因组DNA采用传统PCR技术扩增MTHFR目的片段，随后以RFLP测定MTHFR C677T基因型，结果见表1，酶切电泳图谱见图1。应用Kappa检验分析了上述两种方法测定结果的一致性，Kappa=0.946，95%可信区间为0.906～0.985，表明这两种方法检测MTHFR C677T基因型具有高度一致性。随机抽取基因组模板和对应的全血模板的PCR产物共10例进行测序，两种方法检测的基因型与测序结果完全吻合，测序结果见图2所示，说明以全血为模板、以Cocktail PCR Buffer为缓冲体系的全血PCR直接扩增技术与传统PCR方法检测结果是一致的。

2.2 遗传平衡检验

对提取的基因组DNA采用PCR-RFLP技术测定的MTHFR C677T各基因型频率作Hardy-Weinberg遗传平衡的χ2检验，结果显示MTHFR C677T各基因型频率与期望值基本吻合，符合Hardy-Weinberg遗传平衡（χ2=0.205，P>0.05）。

2.3 同种族不同地区MTHFR C677T基因型的分布特征

对9个中国大陆不同地区的MTHFR C677T多态性研究与对淮安地区205例健康汉族个体的MTHFR C677T传统PCR-RFLP法分型结果共同分析，进行不同地区的中国汉族人群MTHFR C677T位点多态性分布频率的比较，各地区资料见表2。结果表明，不同地区汉族人群的MTHFR 677T等位基因频率差异有显著性，χ2=97.162；随人群居住地理位置由高纬度至低纬度MTHFR 677T等位基因频率逐渐降低，趋势性χ2检验证实中国汉族人群中该等位基因的分布与不同人群居住地的地理纬度有关（χ2=8.869，P=0.001）；对各研究人群的MTHFR 677T等位基因频率与居住地的纬度之间的相关性分析表明，两者之间存在明显的正直线相关关系，rT，纬度=0.917，P=0.0002，排除北京地区研究资料的rT，纬度′=0.958，P=0.0001。

进一步对纬度进行分级，分别为纬度>35°的东北、河北（石家庄）和山东地区，35°>纬度>30°的陕西（西安）、江苏（淮安）、上海地区和纬度

其中纬度最高的北方汉族人群的T等位基因发生频率最高，纬度最低的广东和贵州地区人群最低；北京地区人群的T等位基因频率与典型北方特征不符，可能与其复杂的移民背景有关；西安、上海和淮安人群的T等位基因频率χ2检验结果显示，在相似纬度的地理条件下，儿童与成从及老年人的T等位基因频率无明显差异，表明MTHFR C677T多态性与年龄分布无关，主要受到遗传因素的影响。

3 讨论

本研究在多态性检测中应用的全血PCR直接扩增技术可以直接采用全血作为PCR反应的模板，与传统PCR-RFLP比较降低了成本、简化了操作，污染机会减少。分析结果表明该方法与传统PCR-RFLP法的分析结果具有高度一致性（Kappa= 0.946），测序结果也说明了这一点。该方法在现场大规模人群疾病易感基因的快速筛检和临床基因型别的快速诊断方面具有重要的实用价值。

应用全血PCR直接扩增技术对淮安人群MTHFR基因多态性的研究结果显示，MTHFR C677T多态的基因型频率分别为CC 32.68%、CT 46.83%、TT 20.49%；C和T等位基因频率分别为56.10%和43.90%。人类MTHFR基因位于染色体1p36.3，包括11个外显子和10个内含子，cDNA全长2.2kb，编码分子量为74 600的蛋白。MTHFR是叶酸代谢中的关键酶，其氨基酸序列高度保守，如在叶酸结合结构域的MTHFR基因677位碱基C被T置换，产生Ala 222 Val错义突变，其合成的蛋白质会出现热稳定性降低和酶活性的改变。有研究表明纯合突变基因型（T/T）编码蛋白的酶活性仅相当于纯合野生基因型（C/C）的30%，而杂合基因型（C/T）编码蛋白的酶活性则相当于C/C 编码酶活性的65%。由于MTHFR的缺陷，导致了血液中5-甲基四氢叶酸的降低和同型半胱氨酸的堆积，使得作为甲基供体的蛋氨酸合成障碍，最终引起DNA的甲基化水平异常，体内外研究表明慢性叶酸或甲基缺乏与DNA甲基化异常有关，并会造成DNA链断裂、染色体重组改变和分离异常，干扰DNA合成和DNA损伤修复［15］。现有研究发现，MTHFR多态性在不同营养条件下的生物学效应有明显差异［15～17］，表明其在体内代谢过程的复杂性，因此，对MTHFR多态性的认识有助于我们了解叶酸代谢的个体差异，为进一步研究其与相关疾病的关系提供基础。

不同种族和地区的MTHFR C677T多态性研究结果表明这一多态性具有种族和地区的分布差异。其中非洲黑色人种的T等位基因频率较低，且居住不同地区的该种族人群具有不同的突变频率；欧洲与亚洲人群突变率较高，在中国人中不同民族的T等位基因频率亦有明显差异［17～19］。考虑到中国汉族人群地域上的分散性和长期环境因素对基因突变频率的影响，我们将本研究人群的基因型资料与9个汉族MTHFR C677T基因型资料进行了比较，结果表明不同地区汉族人群的MTHFR 677T等位基因频率有显著差异，表现为与地理纬度的高度相关；高纬度北方汉族人群的T等位基因发生频率最高，达62.41%，随着人群居住地理纬度的降低，MTHFR 677T等位基因发生频率迅速降低，至纬度最低的广东地区人群MTHFR C677T位点的突变频率降至19.6%，趋势性χ2检验证实该等位基因有纬度分布的依赖性。对35°>纬度30°地区不同年龄阶段（儿童、成人及老年人）的T等位基因频率的分析表明MTHFR C677T多态性与年龄分布无关，结合不同地区MTHFR C677T多态性的分布特征，推测MTHFR C677T位点的多态性可受到地理环境的影响，可能与不同纬度的主导环境致突变物对不同居住人群的遗传选择有关。研究中发现北京的社区对照人群的基因型频率不具有典型的北方分布特征，考虑由于北京的移民人口较多，地区和生活方式的南北差异已不易分辨，可能存在一定的混杂。综上所述，在探讨MTHFR基因多态性时应充分考虑不同种族和地区人群中的基因分布特征。

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