乳酸菌筛选及活力影响因素

本文作者：王俊国包秋华陈永福刘文俊丹彤张和平作者单位：内蒙古农业大学食品科学与工程学院乳品生物技术与工程教育部重点实验室

心血管疾病是当前导致人类死亡的最主要原因，大量流行病学和临床研究的结果表明：在胆固醇含量与心血管疾病之间存在着显著的正相关，血脂中总胆固醇的减少能降低高血脂人群患心血管疾病的风险[1]。研究发现，经常食用一些益生菌(主要是乳酸菌)的发酵制品及其制剂有助于降低血液胆固醇的含量[2-4]。而许多研究者认为乳酸菌降低胆固醇与其所产生的胆盐水解酶有着密切联系。胆盐水解酶(BSH)是微生物生长、繁殖过程中产生的一种代谢产物[5]。该酶主要由乳酸菌产生，能水解结合态牛磺酸胆盐和甘氨酸胆盐，将其转变成氨基酸和游离胆酸。

人们在几种肠道固有的乳酸菌中都发现了BSH[6-8]。在降胆固醇菌株的筛选上，是否具有BSH活性已成为一个重要的指标，不少科学家越来越关注BSH和乳酸菌降胆固醇之间的关系[9-11]。乳酸菌的BSH活性，除了具有降低体内胆固醇和保护菌体细胞免受毒害及提高细胞自身活力等功能外，还能提供肠道微生物生长所需的能量，抗胆盐毒性作用，提高肠道乳酸菌对病原菌的拮抗作用，维护肠道菌群平衡等作用[5]。因此筛选具有BSH活性的乳酸菌有着重要意义。

本研究的目的在于筛选分离自新疆及蒙古国酸马奶中的含有胆盐水解酶活性的乳杆菌菌株，并通过体外实验对影响乳酸菌胆盐水解酶活性的一些因素进行研究。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验菌株

从蒙古国及新疆酸马奶样品中筛选出的10株耐酸性、耐胆盐较好的菌株，它们是D4401、LIP-I、E7301、XB4-1、F6306、MG1-2、MG9-2、MG13-3、MG16-3、MG18-1。1.1.2实验试剂胆盐：分析纯，Difco公司；胆固醇、邻苯二甲醛、巯基乙酸钠、正己烷、冰醋酸：上海国药公司，分析纯；脱氧牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠：分析纯，美国Sigma公司；甘氨酸：美国Sigma公司，色谱纯。

1.2实验方法

1.2.1胆盐水解酶活力的定性检测[12]

在MRS液体培养基中添加0.3%脱氧牛磺胆酸钠、0.2%巯基乙酸钠(THIO)、0.37g/LCaCl2和1.5%琼脂，121℃15min灭菌后倾倒入灭菌平皿中，凝固后倒置放入厌氧罐(BBL)中48h后取出。将无菌滤纸片放入平皿中，在每个滤纸片上滴加10μL菌液，平皿再次放入厌氧罐中，37℃培养72h。观察滤纸片周围有无白色沉淀物生成。

1.2.2胆盐水解酶活力的定量检测[13]

将供试菌株，按2%接种量接种于含有0.3%甘氨胆酸钠的200mLMRS-THIO培养基中，37℃培养24h后，通过HPLC测BSH活力。HPLC色谱条件：Agilent1100HPLC系统(Agilent，USA)：高压二元泵、荧光检测器、在线脱气机、自动进样器；Agilent色谱工作站(Agilent，USA)，Sep-PakC18(100mm×8mm)，荧光检测波长205nm，进样量20μL，峰面积计算用ChemResearchSoftware，甘氨胆酸的流速1.0mL/min，所用有机溶剂均为色谱纯。流动相：700mL甲醇和300mL0.02mol/L乙酸混合用5mol/LNaOH调其pH为5.6，通过0.45μm聚丙烯过滤器过滤。配制2.00mmol/L甘氨酸(GLY)的溶液，作为标样，并稀释至0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mmol/L，利用HPLC法测定甘氨酸含量。HPLC条件与样品相同，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.3不同pH值对BSH活力的影响[14]

将菌株接入30mLMRS-THTO培养基中培养后，离心收集菌体。用0.5mmol/LpH7.0的磷酸缓冲液洗涤菌体2次，在600nm处调整不同菌株间OD值在5.0，5等份后分别加入1mLpH值为4、5、6、7、8含有2mmol/L甘氨胆酸钠的磷酸缓冲液，厌氧37℃培养8h后，震荡均匀。离心后取上清液加入等体积15%的三氯乙酸再次离心，取上清液利用HPLC法测定不同pH值条件下甘氨酸的含量。

1.2.4不同超声波破碎时间对BSH活力的影响[15]

如前所述方法，制备OD值在5.0的菌液，加入10mmol/L的二硫苏糖醇(dTT)防止酶的氧化，置冰浴在超声波破碎仪功率为100W下破碎，每隔3min取样累计21min，在12000r/min、4℃离心10min后取上清液，上清液即为菌体破碎液。在180μL0.1mmol/LpH6.0的磷酸缓冲液中加入10μL上清液、10μL2mmol/L甘氨胆酸钠、10mmol/L的dTT。37℃水浴30min加入等体积15%的三氯乙酸终止反应，在4℃、12000r/min离心10min后，取上清液利用HPLC法测定不同超声波破碎时间下甘氨酸的含量。

1.2.5氧化还原电位(O/R)对BSH活力的影响[16]

在600nm处调整不同菌株间OD值在5.0，3等份后每份加入10μL、2mmol/L甘氨胆酸钠，其中一份加0.2%THIO置于厌氧罐中，另一份置于厌氧罐中，剩下的一份不作任何处理。37℃下培养8h后，12000r/min、4℃离心10min后，取上清液利用HPLC法测定甘氨酸的含量。

2结果与分析

2.1胆盐水解酶活性的定性检测结果

由于胆盐水解酶可以水解结合态胆盐，将其转变为氨基酸和游离胆酸，游离胆酸可以和培养基中的CaCl2反应，产生白色沉淀。因此，含有胆盐水解酶活性的乳酸菌会在滤纸片周围产生白色的沉淀圈[17]。在10株实验菌株中，有3株菌在滤纸片周围产生明显的白色沉淀，表示这些菌株可能具有胆盐水解酶活性，它们分别是MG13-3、XB4-1、MG16-3。它们在培养基中的生长情况如图1所示。利用16SrDNA序列同源性分析对这3株菌进行了鉴定，结果显示，MG13-3和MG16-3是发酵乳杆菌(L.fermentum)，在GenBank/EMBL/DDBJ上序列注册号是EU287483和EU688978，XB4-1是开菲尔乳杆菌(L.Kefiranofaciens)，在GenBank/EMBL/DDBJ上序列注册号是EJ172344。

2.2胆盐水解酶活性的定量检测结果

具有胆盐水解酶活力的菌株可以水解甘氨胆酸钠，产生甘氨酸和游离胆酸，胆盐水解酶活性越大，生成的甘氨酸越多，对应的峰面积越大，同时甘氨酸的出峰时间在11.3min，用HPLC法通过测定不同甘氨酸浓度时的峰面积，就可以得到甘氨酸浓度值，进而可知水解酶活力的高低。从图3~图5及表1可知，用HPLC法测定出MG16-3、XB4-1、MG13-3产生的峰面积分别是86.34364、127.28943、274.39850。根据标准曲线(见图2)，查得对应的甘氨酸浓度分别是0.0909、0.1340、0.2889μmol/mL。.结果表明，这3株乳酸菌胆盐水解酶活性从小到大的顺序为MG16-3、XB4-1、MG13-3，初筛中选择的对照菌株MG16-3产生的白色沉淀圈较小，利用HPLC对其检测的结果表现出较低的胆盐水解酶活性(0.0909μmol/mL)，验证了初筛过程的准确性。为了更准确地评估菌株胆盐水解酶的活性，我们利用HPLC对其余7株菌进行了检测，结果表明它们水解产生甘氨酸的量极低，胆盐水解酶活性较弱。

2.3影响BSH活力因素的研究

一些研究表明：不同的pH值，超声波对菌体破碎不同时间，以及氧化还原电位的高低都会对乳酸菌的生长和胆盐水解酶活力有影响。我们选用MG16-3、XB4-1、MG13-33株菌来探讨环境因素对乳酸菌胆盐水解酶活力的影响规律，并对菌株产胆盐水解酶的最佳培养条件进行研究。

2.3.1不同pH值对BSH活力的影响

从图6可知3株菌均在pH6时BSH活力最高，说明pH6是这3株菌胆盐水解酶作用的最适pH值。

2.3.2不同超声波破碎时间对BSH活力的影响

图7表明：超声波破碎时间对BSH活力有明显影响，MG16-3、MG13-32株菌在0~15min内BSH活力一直处于上升趋势，之后呈现下降趋势；而XB4-1在0~12min是上升趋势，之后呈现下降。这说明了在100W的功率下超声波破碎12~15min是这3株菌提取BSH的最佳时期，因为BSH是乳酸菌体内的一种胞内酶，在0~12min内，BSH随着破碎时间的延长，不断地从细胞内释放出来，在12~15min胞内所有BSH被释放出来，之后BSH活力降低可能是因为超声波破碎对该酶有破坏作用，随着时间的延长，破坏强度逐渐增强。2.3.3氧化还原电位(O/R)对BSH活力的影响图8结果表明，在有氧条件下3株菌BSH活力很低，置于厌氧罐中BSH活力明显增强，而在加入巯基乙酸钠(THIO)且放置于厌氧罐中，BSH活力是三种情况下最强的，这充分说明了BSH活力的产生对厌氧环境有强烈依赖性，故低的氧化还原电位(O/R)是BSH生成的必要条件。

3讨论

自从Klaver和VanDerMeer(1993)[18]通过体外实验提出了共沉淀理论后，围绕着BSH的争论就一直不断[15-17]。随着时间的推移，越来越多的证据表明BSH在人体内对胆固醇的降低起着重要作用[5,7,11,14-16]。

对于人类和其他哺乳动物而言，胆固醇的主要排泄途径是通过粪便。胆汁是肝细胞利用胆固醇合成的并以结合胆盐的形式贮存在胆囊中。结合胆盐分泌进入小肠后有助于脂溶性维生素及其他膳食中脂溶性物质的吸收。在促进脂类消化吸收的同时，胆汁受到肠道(小肠下端及大肠)内细菌作用而由结合胆盐变为脱结合胆盐[1]。脱结合胆盐与结合胆盐相比其溶解性较低，这导致其在小肠内吸收性降低并随粪便排出[2]。当含有胆盐水解酶的益生菌进入肠道后，将使大量的结合胆盐变为脱结合胆盐，要维持正常的肠肝循环就必须有更多的胆固醇合成新的胆盐来补充排泄掉的那部分(胆固醇是胆盐的前提物质)，从而起到了降低血液胆固醇的作用[11-13]，同时由于游离胆盐的增多将造成肠道中脂类的溶解和吸收率的下降，促使更多的脂类随粪便排出体外，对降低血脂也有一定的作用[1]。

胆盐水解酶的影响因素除了菌种本身外，环境因子也起重要作用[9-11]。不同菌种产生胆盐水解酶的条件有所不同。为此，我们对分离自新疆和蒙古国酸马奶样品中的10株有较好的益生特性的乳杆菌进行了胆盐水解酶的定性筛选及定量测定并对影响BSH活性的因素进行了研究。尽管许多人认为有胆盐水解酶活力的菌株必须来源于富含有胆盐的环境，例如分离自人或动物的肠道或粪便，而分离自蔬菜和发酵乳制品的菌株一般不具有胆盐水解酶活力[19-20]，但从我们的试验结果来看，从发酵乳制品中也可以分离出具有胆盐水解酶活性的乳酸菌，所以我们认为具有胆盐水解酶活力的菌株并不一定要来自富含胆盐的环境。

本实验证实3株菌的胆盐水解酶最适作用pH值为6，同时其对厌氧环境有强烈的依赖性，而人体小肠上段正常pH值为5.5~6.5，同时肠道内的厌氧环境也符合胆盐水解酶作用的条件，这从另一方面证实人体内有适合胆盐水解酶作用的外在条件。

4结论

通过钙圈法对10株乳杆菌进行了定性筛选，其中MG13-3、XB4-1、MG16-33株菌产生了白色沉淀圈，表示它们具有胆盐水解酶活性。利用HPLC法对MG13-3、XB4-1、MG16-33株乳杆菌的胆盐水解酶进行了定量测定，3株菌的胆盐水解酶活性从小到大依次为：MG16-3、XB4-1、MG13-3。通过研究我们发现，在体外胆盐水解酶的最适pH为6.0；在100W的功率下，超声波破碎时间在12~15min时，酶活力体现较强；低的氧化还原电位(O/R)是BSH生成的必要条件。