酸菜中优良乳酸菌株的筛选

摘要：乳酸菌是非常重要的生理菌群，在肠道无毒、无副作用，对人类和动物的身体起着各种重要的生理功能。本研究以企业提供的样品为材料，通过划线、梯度稀释进行MRS培养基定向的筛选与分离，最终获得一株优良的乳酸菌菌株。

关键词：酸菜 乳酸菌 筛选

中图分类号：Q93-331 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2013）14-0041-02

微生态发酵食品是一种绿色环保食品，专门用于食品发酵的一类微生物添加剂，由乳酸菌、酶和一些营养物组成，主要作用是有目的地调节食品内微生物区系，调控发酵过程，促进乳酸菌大量繁殖、更快地产生乳酸，促进多糖与粗纤维的转化，从而有效地提高食品的质量，所以具有足够数量和活力且保证较长货架寿命的发酵剂的生产和供应成为先决条件。

1 主要仪器及实验材料

1.1 实验培养基

（1）液体MRS培养基：酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，吐温80g/L，乙酸钠5g/L，牛肉粉10g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁 0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，蛋白胨10g/L，蒸馏水配制，pH 6.2～6.6。（2）CaCO3MRS固体培养基：在MRS液体培养基基础上加0.5%的CaCO3。

1.2 主要仪器

78HW-1恒温磁力搅拌器，杭州仪表电厂；SY-2-4电热式恒温水浴锅，天津市欧诺仪器仪表有限公司；DT5-1低速离心机，北京时代北利离心机有限公司；78-1磁力加热搅拌器，上海南汇电讯器材厂；LDZX 50KB高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；ALC-2100电子天平，上海精密仪器仪表有限公司。

1.3 常用溶液 生理盐水

NaCl：8.5g/L；盐酸：4%。

1.4 实验材料

市售酸菜。

2 实验方法

2.1 菌株的筛选及分离

100mL三角瓶装30mL生理盐水，灭菌后待用。4℃冰箱中取出贮存样品，取3mL装于装有30ml蒸馏水的三角瓶中，然后摇床振荡10min，再静置5min，即成10-1稀释度的样品溶液。按照梯度稀释法制备10-3的稀释溶液。取每个梯度的稀释溶液各200μL，涂于含有CaCO3的MRS固体培养基平板上，于37℃恒温箱培养。

菌落出现后，根据菌落形态的差异挑取菌落，然后接种于液体培养基中，37℃振荡培养，并将培养基贴纸记号为S1、S2、S3。再进行梯度稀释，最后通过菌落划线等方法，最终获得单一纯化的菌株，保藏。

2.2 菌株鉴定

（1）将筛选到的乳酸菌株划线接种于含有CaCO3的MRS培养基中，37℃恒温培养，然后考核菌落的形态。（2）基因组DNA的提取：取37℃恒温培养2d的菌液，10，000 rpm离心10min，取沉淀，沉淀为菌体。将制备的菌体加入500μL溶菌酶液，37℃保温1h，1h后补加溶菌酶液100μL，再45℃作用30min，直至透明。将制得得透明溶液加10%的SDS，使浓度达到2%，去除杂蛋白，13，000 rpm离心10min。取上清液，再分别用等体积酚、酚：氯仿、氯仿依次进行抽提。上层溶液加等体积异丙醇沉淀10min，再13，000rpm离心15min。沉淀用30μL无菌水溶解，备用。

（1）扩增与分析选用引物p7F和1492R，以分离菌株的基因组DNA为模板，以便扩增。程序设定为95℃为5min，94℃为1min，50℃为1min，72℃为1min，30个循环后72℃延伸10min。扩增产物回收纯化，进行序列测定。所测得的序列与基因库中的16SrDNA进行Blast分析。

3 结果

3.1 乳酸菌的筛选分离

经过稀释涂平板、形态观察和16SrDNA检测等步骤，从企业提供的样品中分离得到3种菌株。经比较分析，确定S3为乳酸菌，如图1所示，S1为屎肠球菌（E.faecium）、S2为粪肠球菌（E.faecalis），对S3乳酸菌进一步深入研究。

3.2 菌株的鉴定

（1）菌落形态观察：经染色，S3为革兰氏阳性菌；生长良好，呈乳白色，表面光滑（图1）。经观察，呈球状，如图2所示。

（2）16SrDNA保守序列分析：经扩增，扩增出1，500bp的16SrDN段。扩增产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒的纯化，连接到pEASY-T3载体上，选取阳性克隆测序。经测序结果的序列进行拼接，得到16SrDNA序列。经Blastn对比，得知所得序列与已报道的Lactobacillus菌株的16SrDNA有100%的一致性，确定其为Lactobacillus。

4 讨论

本研究将样品置于cMRS中，37℃选择性的增殖了乳酸菌，消除了其他菌体的干扰，通过基因组DNA抽提、16SrDNA保守序列分析及电泳，最终鉴定S3为Lactobacillus。

参考文献

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