肝肾不足型斑秃患者PBMC中Th1/Th2型细胞因子转录因子T-bet mRNA表达状况

(广东省中医院皮肤科，广东广州510120)

摘要：目的：探讨肝肾不足型斑秃患者外周血单核细胞(PBMC)中Th1/Th2型细胞因子、转录因子T-betmRNA表达状况与斑秃发病的关系。方法：用逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测8例轻型斑秃、12例重型斑秃(肝肾不足型)患者及10例正常人外周血单一核细胞(PBMC)经PHA刺激后Thl型细胞因子(IFN-γ、IL-12)、Th2型细胞因子IL-10及转录因子T-bet mRNA的表达水平。结果：经PHA刺激后轻型斑秃患者PBMC中Th1型细胞因子(IFN-γ、IL-12)基因表达水平轻度升高，与正常对照组比较无显著性差异(P＞0.05)；Th2型细胞因子(IL-10)基因表达下降，显著低于正常对照组(P＜0.05)；转录因子T―betmRNA表达水平明显升高，显著高于正常对照组(P＜0.05)。重型斑秃患者PBMC中Th1型细胞因子(IFN-γ、IL-12)及转录因子T-bet基因表达不仅显著高于正常对照组(P＜0.01)，而且还高于轻型斑秃病人(P＜0.05)；Th2型细胞因子(IL-10)基因表达显著低于正常对照组(P＜0.05)，与轻型斑秃病人比较无显著性差异。结论：肝肾不足型斑秃患者PBMC中Thl/Th2型细胞因子基因表达失衡，呈现以Th1型细胞因子和转录因子T-bet基因过度表达为特征的Th1型反应，可能参与了斑秃的发病机制，也可能是斑秃肝肾不足证型的微观本质之一。

关键词：斑秃；细胞因子；T-bet；基因表达；肝肾不足

中图分类号：R758.71　文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)05-0937-03

斑秃是以突发性的非疤痕性的毛发脱落为特征，常表现为斑片状头发脱落，小部分可发展为头发完全脱落(全秃)或除全秃外体毛亦脱落(普秃)。本病可发生于任何年龄，尤其好发于儿童及青少年，发病率较高，国内Yang等调查了1032例斑秃患者占同期门诊量的0.9％。斑秃的病因病机至今尚未明了。有关C3H/HEJ鼠斑秃模型及人类斑秃方面的研究表明：CD4+细胞在斑秃的发病机制中起着重要作用。而斑秃患者局部或循环中的Th1/Th2细胞因子平衡与否是影响CD4+(Th)细胞分化的关键。目前多数学者倾向于认为斑秃是在遗传易感性的基础上，由于各种激发因素作用下自身免疫功能失调所致的针对生长期毛囊以Th1型反应为特征的器官特异性自身免疫性疾病。

本研究选取用γ干扰素、白介素12代表Th1型细胞因子，以白介素10代表Th2型细胞因子，采用RT-PCR法检测肝肾不足证型患者外周单一核细胞(PBMC)经PHA刺激后T-bet及Th1/Th2型细胞因子基因的表达状况，以探讨斑秃肝肾不足证型中医的微观本质及与发病的关系。

1研究对象和方法

1.1研究对象

所有病人均为2004年8月－12月广东省中医院皮肤科门诊斑秃患者，共20例，其中轻度局限型斑秃8例，重型斑秃12例(包括脱发面积达30％以上的斑秃4例、全秃5例、普秃3例)；其中男11例，女9例；年龄14～52岁；病程2个月～6年。另设正常人对照组lO例，男6例，女4例；年龄20～38岁，为健康献血者。

1.1.1诊断标准　参考1997年卫生部《中药新药临床研究指导原则》第3辑：中药新药治疗秃发症的临床研究指导原则。

斑秃的诊断标准：突然或短期内头发片状脱落；脱发区皮色正常，无明显的炎症反应；脱发区皮肤未见萎缩及疤痕；斑秃为斑片状脱发，可单发或多发(斑片型)；重型斑秃为脱发面积达头皮30％以上。包括全秃(头发全部脱落)、普秃(除全秃外还有眉毛、胡须、腋毛、及毳毛的普遍脱落)。

肝肾不足证中医辨证标准：多见于中年以上或发于久病以后，头发焦黄或花白，片状或弥漫性脱发，伴有腰膝酸软，头晕耳鸣，舌质淡，苔少，脉沉细。

1.1.2纳入标准　符合斑秃诊断标准及肝肾不足证型辨证标准者；年龄11～60岁，性别不限；近2个月内未系统使用过皮质激素或其它免疫抑制剂及免疫调节剂，亦未内服可能影响免疫功能的中药制剂。

1.2方法

1.2.1外周血PMBC中总RNA的提取　按试剂盒说明采用TRIzol(购自Ivitrogene公司)一步法提取总RNA。

1.2.2RT-PCR cDNA合成：根据逆转录酶(M-MLV，购自Ivitrogene公司)说明书操作。

PCR扩增：总反应体积为25μL，包括加入双蒸水16.25μL，10×buffer 2.5μL，dNTP混合液2μL，上下游引物各1μL，cDNA模板2μL，TaqDNA聚合酶(购自Takara公司)0.25μL。在PCR(UNOⅡ型，Biometra公司产品)扩增仪内扩增。反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性45s、50℃退火30s、72℃延伸60s，循环30次，72℃延伸10min。以β肌动蛋白作为内参照，各样本基因表达强度=样本灰度值／β肌动蛋白灰度值。

引物序列：T-bet(上游)：5'-GTGACCCAGATGATTGT GCT-3'，(下游)：5'-GGTTGGTAGGAGAGGAGAG-3'，扩增产物366bp。IL一10(上游)5'-GTGACCCAGATGATTGTG CT-3'，(下游)：5'-GGTTGGGTAGGAGAGAGAG-3，扩增产物219bp。IL-12P40(上游)5'-GTGACCCAGATGATTGTGCT-3'，(下游)：5'-GGTTGGGTAGGAGAGGAGAC-3'，扩增产物452bp。上述引物由上海博亚公司合成。

1.2.3统计学方法　所有实验数据输入SPSS11．统计软件分析处理。各组间细胞因子基历表达量比较采用方差分析，细胞因子间的相关性采用相关分析。

2.2相关性分析显示

γ干扰素与转录因子T-bet呈高度正相关(r=0.806，P＜0.001)；γ干扰素与IL-12呈正相关(r=0.792，P＜0.001)；γ干扰素与IL-10无明显相关性(P=0.556)；IL-10与IL-12无显著相关性(P=0.157)；T-bet与IL-12呈显著正相关(R=0.693，P＜0.001)；T-bet与IL-10无明显相关性(P=0.439)。

3讨论

3.1 Tn1/Th2型细胞因子和转录因子T-bet基因表达与斑秃发病的关系

本课题研究显示轻型斑秃患者PBMC中Th1型细胞因子γ，干扰素及白介素12表达水平轻度升高，与正常对照比较无显著性差异(P＞0.05)；Th2型细胞因子IL-10基因表达水平下调，显著低于正常对照组(P＜0.05)；转录因子T-bet基

因表达水平显著高于正常对照组(P＜0.05)。轻型斑秃患者Th1/Th2型细胞因子基因表达轻度失衡,Th1型反应可能也参与了轻度斑秃的发病机制。

重型斑秃患者PBMC中Th1型细胞因子γ干扰素、白介素12及转录因子T-bet基因表达水平均显著高于正常对照组(P＜0.01)；γ干扰素及转录因子T-bet基因表达水平还显著高于轻型斑秃病人(P＜0.05)。Th2型细胞因子IL-10基因表达水平下调，显著低于正常对照组(P＜0.05)。重型斑秃患者表现为典型的Th1型反应特征，转录因子T-bet及Th1型细胞因子基因表达过度可能是重症斑秃的主要病机之一。

T-bet(T-box expressed in T cells)是T-box家庭的新型转录因子，选择性地表达于Th1型细胞表面，在Th1型细胞的分化中起决定性作用。在Crohn病患者中Th1型细胞因子如γ干扰素的表达升高，肠道上皮黏膜固有层细胞胞桨及胞核中T-bet均强表达，而T-bet基因敲除的T细胞不能介导Th1相关性肠炎(crohn病)。由于T-bet基因是调控Th1/Th2分化的重要因素，T-bet与Th1／Th2相关性疾病的联系成为众人关注的研究焦点。但目前国内外暂未见有关转录因子T-bet在调节斑秃病人PBMC中Th1细胞分化及细胞因子基因表达方面的文献报导。本研究结果初步显示：重型斑秃患者PBMC中Th1型细胞因子基因过度表达，Th2型细胞因子基因表达受到抑制，转录因子T-bet基因表达水平显著增高，相关分析表明T-bet与IFN-γ(R=0.806，P＜0.001)及IL-12(R=0.792，P＜0.01)均呈显著正相关。提示重型斑秃患者PBMC中Th1细胞因子基因过度表达，可能是由于T-bet基因表达过度所致。因此抑制Th1细胞因子或转录因子T-bet基因表达有望成为斑秃治疗新的策略和靶位。

3.2Th1/Th2型细胞因子和转录因子T-bet基因表达状况与斑秃肝肾不足证型的关系

目前斑秃的中医病因病机主要涉及：肝肾不足、气血两亏、血虚风燥、气滞血瘀等4个方面，尤以肝肾不足为发病的中心环节。本课题选择肝肾不足证型患者为研究对象，轻型斑秃病人证型较轻，重型斑秃患者肝肾不足症状相对较重，实验研究结果显示两型斑秃患者T-bet及Th1型细胞因子基因表达水平相关。国内姚成芳等分别采用甲状腺素灌胃和氢化可的松肌肉注射法建立阴虚、阳虚BALB/c小鼠模型(生理盐水作对照)；利用RT-PCR方法检测模型动物脾脏单个核细胞中Th1类细胞因子(IFN-γ、IL-2)、Th2类细胞因子(IL-4，IL-10)的基因转录状态。发现阴阳调和的正常小鼠可以同时表达IFN-γIL-2、IL-4,IL-10,处于Th1/Th2平衡状态；阴阳失调模型小鼠在表现明显的阴虚、阳虚体征的同时，其Th1/Th2两型细胞因子mRNA的表达显著降低(P＜0.01)，Th1/Th2平衡模型发生漂移，阴虚小鼠IFN-γ／表达与阳虚模型对比有显著性差异(P＜0.01)，阴虚模型小鼠IFN-γ的表达处于相对优势。本研究所选研究对象为肝肾不足型患者，均存在不同程度的肝肾阴虚症状，实验结果表明重型斑秃患者呈现典型的Th1型细胞因子及转录因子T-bet过度表达，这与姚成芳的研究结论相近。笔者推测重型斑秃患者肝肾不足证型的本质可能与T-bet及Th1型细胞因子基因表达过度有关。