标本的处理对乳汁HBV DNA检测结果的影响

【摘 要】目的：探讨不同样本处理方法对乳汁样本中HBV DNA定量结果的影响，筛选出适合临床实验室检测病毒DNA的样本前处理方法。方法：4℃冰箱过夜后取中间层乳汁进行检测，以离心后的上清液、上清液浓缩、沉淀3种方法平行检测52份大三阳产妇的乳汁HBV DNA含量。结果：沉淀方法检测阳性率明显高于其他2种方法（均P

【关键词】FQ-PCR；HBV DNA；乳汁

【中图分类号】R446.62 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）02-0760-01

我国是乙型肝炎的高流行区，人群乙型肝炎病毒（HBV）携带率高达10%～20%，超过1.2亿，其中40%～50%通过母婴传播[1-2]，母乳含有丰富的营养成分和免疫物质.是婴儿成长最理想的营养品。若母乳HBV-DNA阳性.采取退乳及人工喂养已成为共识[3]。然而，乳汁组成复杂，富含脂肪、蛋白质及乳糖[4]，且乳汁为浑浊非匀相液体，与血清不同，因而适用于血清标本中HBV-DNA检测的方法是否适用于乳汁标本有待探讨。目前国内尚无标准化的乳汁中HBV-DNA检测程序，各学者采用的研究方法和结果不尽相同。建立标准化的乳汁中HBV-DNA检测方法势在必行。本研究仅从乳汁成分对实时荧光定量检测HBV-DNA的影响及HBV-DNA在乳汁中分布情况着手，以期为乳汁中HBV-DNA检测标准方法的建立提供依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 材料收集 分娩24h内的初乳采自2013年1月1日至12月31日在本院产科病房分娩的产妇，其血清HBsAg阳性，血清中HBV DNA拷贝数大于1.0×103IU/mL，谷草转氨酶及谷丙转氨酶均小于40U/L，共52例，平均年龄25.6岁，平均孕龄38周。用温水清洗，然后轻轻挤出初乳约1.5～2.5mL，置于无菌塑料管中，-20℃保存。标本的采集与保存按照本实验室相应标准操作程序（SOP）进行。患者没有失代偿的肝病或肝癌，未检测到HAV、HCV、HDV、HEV和HIV，并已排除酒精性、药物性、中毒性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝病、代谢性肝病。每份标本同时用两种提取法提取HBV DNA模板后，进行HBV DNA实时荧光定量PCR （ FQ - PCR）检测。

1.1.2 仪器及试剂 仪器为美国ABI公司7500 Real Time PCR System检测仪。运行计算机软件为Roche Molecular Biochemicals Light-Cycler Software（Version 3.5.3）。血清HBV DNA检测试剂盒来自上海克隆生物高技术有限公司[国食药监械（准）字2009第3400437号]，生产批号20130501，试剂盒的检出限为5×102IU/ml。DNA标准品为试剂盒中所带的定量标准品，室内质控血清由卫生部临床检验中心提供。本实验室为卫生部临床检验中心技术认可的临床基因扩增检验实验室。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板制备

方法I（上清液） 先取冰箱过夜后的乳汁800μL于一个无菌Eppendorf离心管（Ep管）中；然后4℃，15 000 r/min离心10 min，去除脂肪层，取中问层上清液100μL，加入100μL DNA提取液。

方法II（上清液浓缩） 取经过方法I处理的中间层上清液100μL，接着加等量试剂盒自带浓缩液，充分混合，然后4℃。15 000 r/min离心10 min，弃上清液，最后加入100μLDNA提取液。

方法Ⅲ（沉淀） 去除冰箱过夜后的乳汁上层的乳酪，取中层乳汁100μL于一个无菌Ep管中，4℃，15 000 r/min离心10 min。弃上清液，加入100μL DNA提取液。

1.2.2 扩增 扩增反应条件为50℃反应2分钟，然后94℃保温5分钟，再按93℃30秒60℃90秒（循环40次）。60℃采集FAM荧光通道的信号。

1.2.3 检测结果的解释 扩增运行程序完成后，按仪器及软件要求进行结果保存和数据分析。除检测标本外，本实验设有阳性血清对照、弱阳性血清对照、阴性对照、室内质控品以及4 个定量校准品。定量检测线性范围为103～107IU/ ml，如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值=40，则判定样品的HBV DNA含量小于检测极限。

1.3 数据统计与分析 采用SPSS 17.0软件进行数据处理，统计学方法采用χ2检验，经分析，差异有统计学意义（P

2 结果

3种前处理方法对52份乳汁标本检测结果比较见表1。统计分析表明，方法Ⅲ与其他2种方法比较，其检测阳性率差异有统计学意义（均P

3 讨论

母乳中适于婴儿生长发育的各种营养物质及多种抗病物质是其他人工配方食品不可比拟的，应该大力倡导母乳喂养。然而由于许多传染病可通过哺乳传播，有报道30% ～50%慢性乙肝携带者是由母婴传播的，其原因也包含了哺乳途径，通常新生儿在接种乙肝疫苗6个月后体内的抗体才能达到有效浓度，12个月后乙肝表面抗体的阳转率才达到85%以上，仍有9% ～10%的婴幼儿对疫苗不产生抗体，对乙肝病毒无免疫力，消化道若有黏膜损伤，在母乳喂养期间极易导致感染，因而母乳的安全性是一个不容忽视的问题[5] 。目前，国内外大多临床实验室均采用实时荧光定量PCR检测HBV DNA，所用试剂对血清样本检测结果稳定可靠，但对乳汁样本检测重复性较差。主要是乳汁样本含大量脂肪颗粒，乳液均一性差，使得HBV DNA分布不均匀，由于产妇每天饮食的差异，故每次检测所取样本脂肪颗粒含量不可能完全一致，导致乳汁样本的病毒DNA检测结果不稳定。为提高乳汁样本病毒DNA检测稳定性和重复性，必须对乳汁样本进行合理的前处理，使得经处理的样本检测结果重复性、精密度都能提高到满足实验室质控需要，同时检测结果尽可能地接近真实值。乳汁样本不同的前处理方法，其可靠性、可操作性、经济性、实用性差别较大，因此有必要进行优化筛选[6，7]。

本研究对比了乳清和沉淀的DNA检测结果，发现沉淀的阳性率及DNA浓度均明显高于乳清，而乳清和浓缩乳清的结果没有显著差异。因此，对于乳汁的HBV DNA检测还是应该取沉淀进行检测，因为乳汁中病毒的存在形式可能不同于血清，病毒可能会存在于淋巴细胞内，或附着在细胞、大分子上，检测上清液可能会降低敏感性。通过以上实验研究，我们发现，对乳汁样本病毒DNA检测，样本处理很关键，样本前处理方法不同，检测结果相差很大，甚至有可能出现假阴性结果。因此，在进行乳汁样本检测病毒DNA时，一定要选择合适的前处理方法。

参考文献：

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[3] 马庆海，杨文东.王秀艳.HBsAg阳性产妇血清与乳汁HBV-DNA载量分析[J].中华全科医学， 2011，9（10）：1616-1617.

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[7] 温旺荣，苏芳，吴勇，等.乳汁处理办法对检测HBV DNA结果的影响.I临床检验杂志，2007，25（I）：31.