少林正骨精质量标准研究

摘要：目的 研究少林正骨精的质量控制方法。方法 采用薄层色谱法对制剂中的独活、当归进行定性鉴别。采用高效液相色谱法测定处方中血竭的有效成分血竭素的含量，以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（50∶50）为流动相，检测波长为440 nm。结果 定性鉴别的特征斑点清晰，专属性强，阴性对照无干扰；血竭素在3.997～43.97 ng范围内线性良好，加样回收率为101.26%（RSD=2.84%）。结论 定性、定量方法准确可靠、重复性好，能有效控制少林正骨精的内在质量。

关键词：少林正骨精；薄层色谱法；高效液相色谱法；质量标准

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.11.021

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）11-0056-03

少林正骨精收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂》第6册[1]，由接骨仙桃草、当归、五加皮、独活、羌活、三棱、血竭等20味药组成，具有活血祛瘀、消肿止痛、祛风散寒的功效，用于跌打损伤、积瘀肿痛、腰肢麻木、风湿骨痛。原标准中仅对冰片进行了定性鉴别，无含量测定项。为了完善少林正骨精的质量标准，本试验对其质量标准进行提高研究，建立主药当归、独活的薄层色谱鉴别方法及贵细药材血竭中血竭素的高效液相色谱（HPLC）含量测定方法。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪（美国惠普公司），G1314A VWD紫外检测器；超声清洗器KQ-250型（昆山超声仪器有限公司）；AX 205DR（十万分之一）电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；H-HS数显恒温水浴锅（江苏金坛医疗器械厂）。

血竭素高氯酸盐对照品（批号0811-9302）、独活对照药材（批号120940-200205）、当归对照药材（批号120927-200310），均由中国药品生物制品检定所提供；少林正骨精（河南天地药业有限公司，批号20030501、20030502、20050503）；乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 独活 取本品5 mL，置10 mL量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取独活对照药材1 g，加乙醇10 mL，超声处理10 min，滤过，滤液作为对照药材溶液。按处方配比去除独活，制成缺独活的阴性对照样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。照薄层色谱法[2010年版《中华人民共国药典》（一部）附录ⅥB]试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液及阴性对照溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙醚（18∶3）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰[2-4]。

2.1.2 当归 取本品5 mL，置10 mL量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取当归对照药材0.5 g，加乙醇10 mL，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇l mL使溶解，作为对照药材溶液。按处方配比去除当归，制成缺当归的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。照薄层色谱法[2010年版《中华人民共国药典》（一部）附录ⅥB]试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液及阴性对照溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯（9∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰[5-7]。

2.2 血竭素含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×200 mm， 5 μm）；流动相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（50∶50）；流速：1.0 mL/min；检测波长：440 nm；柱温：40 ℃；理论塔板数按血竭素计算应不低于4000[8-9]。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取血竭素高氯酸盐对照品6.88 mg（血竭素质量=血竭素高氯酸盐质量/1.377），置50 mL棕色量瓶中，加3%磷酸甲醇溶液使溶解，并稀释至刻度。精密吸取1 mL，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密吸取本品5 mL，置具塞锥形瓶中，精密加入3%磷酸甲醇溶液20 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）10 min，50～60 ℃水浴保温1 h，放冷，称定质量，加3%磷酸甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，即得[10-11]。

2.2.4 阴性干扰试验 取处方中不含血竭的其他药材同比例制备阴性样品，按“2.2.3”项下方法操作，制成阴性对照溶液。精密吸取血竭素高氯酸盐对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。阴性对照溶液色谱中无血竭素高氯酸盐相对应的色谱峰，阴性无干扰。见图1。

2.2.5 线性关系考察 精密吸取0.550 4、1.651 2、2.752 0、3.852 8、4.953 6、6.054 4 μg/mL的血竭素高氯酸盐对照品溶液，注入液相色谱仪，测定峰面积。以进样量（ng）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y=1.364X+0.4106（r=0.999 9），表明血竭素在3.997～43.97 ng范围内线性良好。

2.2.6 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液，连续进样6次，每次10 μL，测定峰面积，RSD=0.48%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，于制备后0、2、4、6、7、8 h分别进样，测定峰面积，RSD=1.40%，表明供试品溶液至少在8 h内稳定。

2.2.8 重复性试验 取同一批号样品（20030501）6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，测定血竭素的含量。结果血竭素的平均含量为13.28 μg/mL，RSD=0.43%，表明该方法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验 精密量取已知含量（批号20030501）的样品6份，每份2 mL，置具塞锥形瓶中，分别精密加入浓度为13.76 μg/mL血竭素高氯酸盐对照品溶液2 mL，再加入3%磷酸甲醇溶液20 mL，按“2.2.3”项下方法进行操作，制成6份供试品溶液，进样，测定，并计算回收率，结果见表1。

2.2.10 含量测定 取3批样品（批号20030501、20030502、20050503），每批2份，按“2.2.3”项下方法进行操作，制备供试品溶液，分别进样，测定，按外标法计算含量，结果3批样品中血竭素的含量依次为13.28、12.54、12.99 μg/mL。

3 讨论

本试验选用当归、独活对照药材作为薄层色谱鉴别对照，方法简便准确，专属性强，斑点清晰，重复性好，可作为其他含当归、独活制剂的鉴别参考依据。

含量测定试验中，分别采用以下几种方法制备供试品溶液：①吸取样品5 mL，置分液漏斗中，加50%乙醇5 mL，摇匀，加甲醇-三氯甲烷（2∶8）混合液提取5次，每次10 mL，合并氯仿液，50～60 ℃挥干，残渣加3%磷酸甲醇溶液使溶解，并转移至25 mL棕色量瓶中，加3%磷酸甲醇溶液至刻度，摇匀。②吸取样品5 mL，置具塞锥形瓶中，加3%磷酸甲醇溶液20 mL，冷浸24 h。③吸取样品5 mL，置具塞锥形瓶中，加3%磷酸甲醇溶液20 mL，超声30 min。④吸取样品5 mL，置具塞锥形瓶中，加3%磷酸甲醇溶液20 mL，超声10 min，50～60 ℃水浴保温1 h。结果表明，①法和③法不能从样品中完全提取出血竭素；②法虽可以完全提取出血竭素，但需要放置过夜，时间过长；④法简便易操作，在较短时间内可完全提取出血竭素。故选择④法作为供试品的制备方法。

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（收稿日期：2013-05-12，编辑：陈静）