P4对双氧水诱导SH―SY5Y细胞凋亡的保护作用

【摘要】目的研究p4对双氧水诱导sh-sy5y细胞凋亡的影响。方法体外培养SH-SY5Y细胞，建立双氧水诱导SH-SY5Y细胞凋亡的模型，给予P4进行十预。应用Hoechst染色，测定细胞凋亡率。结果lOuM的双氧水24h可以使SH-SY5Y细胞凋亡率达到（56.33+13.17）%。然而，给予P4后，SH-SY5Y细胞的凋亡率明显减低，P4加双氧水组与双氧水组对比差异有统计学意义（P

【关键词】P4；双氧水；SH-SY5Y细胞；Hoechst33258染色

【中图分类号】R74

【文献标识码】A

【文章编号】1674-0742（2015）06（b）-0045-03

氧化应激长期以来被认为是中枢神经系统退行性疾病f如阿尔茨海默病）神经元损伤的一个主要因素。氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基和活性氮白由基产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。活性氧自由基包括超氧阴离子（.O2-），羟自由基（・OH）和过氧化氢（H2O2）等。过氧化氢（H2O2），作为主要的活性氧，可以改变细胞的细胞内氧化还原状态，诱导氧化损伤其转化成高反应性的羟基白南基。此外，过氧化氢和羟基自由基导致线粒体的结构和功能的损伤，引起细胞凋亡。因此，过氧化氢已经被广泛使用在中枢神经系统的神经毒性和神经保护作用的氧化应激细胞培养模型中。SH-SY5Y是一种分化程度较低的肿瘤细胞，显示中水平的多巴胺-β-羟基酶活性，细胞形态、生理及生化功能与正常神经细胞相似，并具有明显的轴突。有研究表明，P4不仅用于生殖系统，而且对中枢神经系统也有保护作用。该实验主要研究P4对SH-SY5Y细胞的保护作用及机制，为临床治疗中枢神经系统退行性疾病提供实验数据。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年3-10月期间培养的SH-SY5Y细胞作为实验样本，把分化1周的SH-SY5Y细胞分为对照组（什么都不加），双氧水组（只加10uM双氧水），BDNF+双氧水组，DMSO预处理液+双氧水组.DMSO预处理液+Y1036+双氧水组，P4预处理液+双氧水组，P4预处理液+Y1036+双氧水组。24h后除对照组之外，其余都加人lOuM双氧水，放人CO2培养箱中。24h后用Hoechst33258染色，测定细胞凋亡率。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养方法细胞培养液（250mL）：DMEM/F12培养基225mL活性炭吸附的小牛血清或小牛血清37.5mL青霉素/链霉素2.5mL。

用含有FBS的培养液培养SH-SY5Y细胞24h。24h后，用PBS洗2次，用0.5mL胰蛋白酶快速洗1遍，在放人1mL胰蛋白酶，放人CO2，培养箱中5min。然后加入5mL含有FBS的培养液，将细胞充分混匀后进行数细胞。用含C.S.FBS培养液和维甲酸以5xl04，/mL的密度将细胞铺到12孔板中，分化1周。

将DMSO和10nMP4加入到C6细胞中，处理24h。然后提取上清液做为预处理溶液。

1.2.2 双氧水诱导SH-SY5Y细胞凋亡的处理方法应用Hoechst染色，测定细胞凋亡率。按5xl04，/mL的密度将细胞铺到6孔板中。分为3组：正常对照组，不加双氧水；加入5uM的双氧水；加入10uM的双氧水。每组2个孔。24h后，用Hoechst33258染色，测定细胞凋亡率。

1.2.3 P4对SH-SY5Y细胞凋亡的处理方法把分化1周12孔板的SH-SY5Y细胞分为对照组（什么都不加），双氧水组（只加lOuM双氧水），BDNF+双氧水组，DMSO预处理液+双氧水组，DMSO预处理液+Y1036+双氧水组，P4预处理液+双氧水组，P4预处理液+Ylp036+双氧水组。将加入BDNF，DMSO预处理液，DMSO预处理液+Y1036，P4预处理液.P4预处理液+Y1036的细胞放入CO2培养箱中。24h后除对照组之外，其余都加入lOuM双氧水，放人CO2培养箱中。24h后用Hoechst33258染色，测定细胞凋亡率。

1.3 统计方法

该次研究相关数据采用Graphacl Prism 5统计学软件处理，计数资料采用X?检验，计量资料采用F检验。

2 结果

2.1 双氧水诱导SH-SY5Y细胞凋亡的浓度

正常对照组细胞呈椭网或梭形，轴突明显。随着，双氧水浓度增高，细胞损伤也随之加重，胞膜破裂，细胞核固缩、凝聚和碎裂，见图1。采用5uM的双氧水处理SH-SY5Y细胞24h后，凋亡率与正常对照组差异无统计学意义（P=0.6257>0.05）；用10uM的双氧水处理SH-SY5Y细胞24h，凋亡率达到（56.33+13.17）%，与正常对照组差异有统计学意义（CF=5.950，P=0.0377

2.2 P4对SH-SY5Y细胞的保护作用

用lOuM的双氧水处理SH-SY5Y细胞24h后，经Hoechst33258荧光染色，发现有亮蓝色的典型凋亡细胞。加入P4-CM组凋亡细胞明显减少，但是P4-CM+Y1036组凋亡的细胞有所增加，双氧水组与P4-CM组差异有统计学意义（X?=0.7745，F=8.014，P=0.00070.05）。所以，P4对双氧水诱导SH-SY5Y细胞凋亡有保护作用，且是通过增加BDNF释放来起到保护作用的。

3 讨论

中枢神经系统退行性疾病一直被认为是顽固而难治的“三不”（病因不明，疗效不好，预后不良）性疾病。研究证明，神经细胞死亡的形式有：凋亡，坏死，自身吞噬，细胞质增生。过氧化氢（H2O2）是体内氧化代谢的中间产物，属于非白南基活性氧，易穿透细胞膜，与细胞内的还原型铁离子通过Fenton反应生成高度毒性的羟自由基，对多种细胞（特别是脑组织神经元细胞）造成毒性，引起细胞死亡。所以，本研究以H2O2作用于体外培养的SH-SY5Y细胞，造成氧化损伤模型。

本实验首先应用Hoechst33258荧光染色对H2O2诱导SH-SY5Y细胞的浓度进行检测，结果表明，lOuMH2O2处理细胞24h后，凋亡率达到（58.33±13.17）%，5uM的双氧水处理细胞24h后，凋亡率与正常对照组无统计学差异。所以选用10uMH2O2诱导SH-SY5Y细胞凋亡。给予H2O2之前，分别加入BDNF，DMSO预处理液，DMSO预处理液+Y1036，P4预处理液，P4预处理液+Y1036。结果表明加入P4预处理液的细胞比加入DMSO预处理液的细胞，凋亡率明显减少。加入Y1036组比没加Y1036组细胞凋亡率有所增加。该实验证明，P4通过增加BDNF的释放对H2O2诱导SH-SY5Y细胞凋亡起到保护作用。下一步研究P4对小鼠海马损伤是否有保护作用，该研究可能有益于中枢神经系统退行性疾病的治疗。